Dapper1调控Wnt/beta-catenin通路在肝癌发生发展中的作用和机制研究

Hepatocellular carcinoma(HCC)is a malignancy with poor prognosis due to its complex molecular mechanism involving dysfunction of many signaling pathways. Accumulative evidence has showed that abnormal activated Wnt signaling pathway has played an important role in tumorigenesis of HCC by controling cell proliferation,differentiation,renewal of cancer stem cells and apoptosis ect. It has been reported that Dapper1(Dpr1)can be shuttled between cytoplasm and nucleus to inhibit Wnt/β-catenin pathway both in cytoplasm and nucleus.However,its role in the development of HCC and its association with Wnt-β-catenin signaling pathway in HCC has yet not been declared.We found in our premiliary observations that Dpr1 has been downregulated in tumor tissues of HCC patients compared with paratumor areas.In this proposal, to fulther elucidate clinical value of abnormal expressed Dpr1 in HCC, we plan to systemetically analyze its biological functions in the development and progress of HCC by using CRISPR-Cas9 systems to knockdown Dpr1 in HCC cell lines in vitro. Dpr1 conditional knock out mice was generated to establish HCC animal models so as to simulate oncogenic process in vivo. To identify the specific molecules involved in the deregulation of Dpr1 mediated HCC, classical molecule biological methods such as genetic modification, molecular pathway inhibition etc will be adopted. We will further demonstrate our findings in clinical samples to evaluate the role of Dpr1 signaling as a potential target for HCC treatment as well as a diagnosis or prognosis marker for HCC.

耐药和复发转移导致肝炎相关肝癌预后不良，研究表明，肿瘤干细胞（CSCs）可能是导致肝癌耐药和复发转移的主要原因之一。基于预实验研究和文献分析，我们发现Dpr1肝脏条件性基因敲除小鼠化学诱导肝癌的肿瘤发生显著增加，Dpr1的下调可能与肝癌干细胞活化密切相关，参与调控肝癌干细胞自我更新的信号通路。本课题拟通过对肝癌临床样本和细胞系的检测，确认Dpr1对肝癌干细胞调控作用，明确受到Dpr1调控的肝癌干细胞关键分子；通过肝脏条件性基因敲除小鼠模型、CRISPR-Cas9基因组修饰技术、高通量组学分析等技术手段，阐释Dpr1调控肝癌干细胞的具体分子机制，并利用动物体内实验进行证实。系统分析Dpr1的异常表达与复发耐药等临床特征密切相关的之间的关系，进一步明确Dpr1异常表达的临床价值；本研究的结果有望为研发靶向肝癌干细胞的诊疗新技术提供新的思路。

肝癌是我国发病率较高的恶性肿瘤，其病因复杂，恶性程度高，异质性强，并且多数患者确诊时已是晚期，往往预后不良。因此，从不同的分子水平和信号通路的异常表达对肝癌进行分子水平的区别有对于肝癌的个体化治疗是至关重要的。肝细胞癌的发生和发展过程中涉及到多个促癌信号的激活，Wnt/β-catenin 信号通路在调节肝癌细胞分化、增殖、上皮-间质转化和干细胞的更新中起到重要作用。. Dapper（Dpr）则是作为能够拮抗Wnt通路中脚手架蛋白DSH功能的一类蛋白被发现。研究表明Dpr1 在肝癌患者癌组织中呈现下调状态，并且这种下调伴随着胞浆中β-catenin 的积累，然而Dpr1在肝脏中表达及其在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制尚不明确，有待进一步研究探讨。. 既往研究表明在中枢神经系统中Dapper1可以通过促进Beclin1-Vps34-Atg14L复合体的形成促进自噬。我们在体内和体外实验中均发现Dpr1与自噬水平呈现负相关；且在肝细胞特异性敲除Dpr1的小鼠DEN诱癌模型中，Dpr1敲除的小鼠肝癌发生率显著增高。本研究发现在DEN诱导肝细胞癌模型中，肝细胞特异性敲除Dact1小鼠肝细胞癌发生率显著高于WT小鼠，提示在该模型中Dpr1对于肝癌形成具有抑制作用。对肝癌患者癌及癌旁样本检测发现，Dpr1在肝癌患者癌组织中低表达，进而明确了Dpr1的抑癌作用。体外实验检测肝细胞特异性敲除Dact1小鼠及WT小鼠原代肝细胞以及Dpr1稳定过表达及对照肝癌细胞系发现，Dpr1干扰后细胞自噬水平显著降低，细胞衰老减少且DNA损伤加重，以上生物学过程的改变在DEN诱癌过程中共同导致肝细胞特异性敲除Dact1小鼠肝细胞恶性转化增加。进一步的机制探讨发现肝细胞特异性敲除Dact1小鼠诱癌过程中Wnt/beta-catenin信号不是介导表型的主要机制，但是我们发现PTEN表达量下调同时p-Akt信号通路活性增强。研究表明Dpr1过表达细胞中出现明显的泛素化PTEN堆积，提示PTEN降解速率减慢，Dpr1参与PTEN稳定性的调节。. 本研究明确了Dpr1在肝癌发生发展中的抑制作用，阐释了其通过介导细胞自噬和DNA损伤修复调控肝癌进展的机制，并发现Dpr1在调控PTEN降解，参与其稳定性调节中的作用。本研究探讨了Dpr1在肝癌治疗及预后判断中的潜在价