与流感病毒NP蛋白发生相互作用的宿主蛋白靶点辨识及栀子环烯醚萜苷的干预作用研究

Prevention and control of influenza epidemic is a serious task around the world. In previous study, we have found that iridoid glycosides extracted from Fructus Gardeniae inhibited virus replication, improved immune function by interfering with the interaction of influenza virus and host factor. In this project, the host factor proteins were identified by the yeast two-hybrid system with the influenza virus NP protein as bait. To confirm the host factors that play a key role in the process of influenza virus replication, the interaction was verified by immunoprecipitation and virus titer detection after siRNA interference on the basis of the structure and function of proteins. Then, 2-3 kinds of host factor targets were selected. Elisa, qRT-PCR, western blotting, dual-luciferase reporter gene were used to observe whether the iridoid glycosides extracted from Fructus Gardeniae play a role in inhibiting the replication of virus, enhancing the anti-virus innate immune function by interfering with influenza virus and host factor target interaction. This study will reveal the mechanism of traditional Chinese medicine prevent and control the spread of influenza virus on the basis of virus-host interaction. Furthermore, the results will provide experimental evidence for the discovery of novel potential targets for anti-virus and development novel anti-influenza traditional Chinese medicine.

防控流感流行是世界范围内的严峻任务，课题组前期研究发现栀子环烯醚萜苷可能通过干预流感病毒与宿主因子相互作用来抑制病毒增殖、提高宿主免疫功能，从而发挥防治流感的作用；本项目首先以流感病毒NP蛋白为切入点，采用酵母双杂交系统辨识出与其发生相互作用的宿主因子，并采用免疫共沉淀和siRNA屏蔽后病毒滴度检测等方法分别在结构和功能上进行验证，以明确在流感病毒增殖过程中发挥关键作用的宿主因子；然后选取2-3种宿主因子靶点，采用Elisa、qRT-PCR、western blotting、双荧光素酶报告基因等方法分别在整体和细胞水平，观察栀子环烯醚萜苷是否通过干预流感病毒与宿主因子靶点的相互作用，来发挥抑制病毒增殖、提升抗病毒固有免疫功能的作用，从而揭示其防治流感的作用机制，为科学阐释中医药防治病毒性疾病作用机制提供新思路，为发现新型抗病毒的宿主靶标提供实验基础，为研发新型抗流感病毒中药提供示范研究。

本项目以流感病毒NP蛋白为诱饵的酵母双杂交实验，筛选与流感病毒NP蛋白发生相互作用的宿主蛋白，对酵母双杂交筛选出的参与流感病毒增殖的宿主因子进行结构和功能的验证，进行正反向co-ip实验观察流感病毒NP蛋白和宿主蛋白的相互作用，采用siRNA干扰后双荧光素酶报告基因技术检测宿主因子对流感病毒增殖的影响，观察栀子环烯醚萜苷对流感病毒感染后，对固有免疫功能IFN及其相关功能的影响。除此之外，利用蛋白质芯片技术，筛选出与甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）核蛋白（NP）、非结构蛋白（NS1）相互作用的人类宿主蛋白，对靶标蛋白进行生物信息学分析；采用Lab-free质谱蛋白质组学分析栀子环烯醚萜苷对流感病毒FM1株感染致小鼠病毒性肺炎的蛋白表达量的变化，并进行生物信息学分析，为广泛、深入、客观研究与流感病毒蛋白与宿主因子的相互作用提供完整的实验支撑。根据筛选和验证与流感病毒NP蛋白发生相互作用的宿主蛋白结果，重点选择宿主因子PACT、CAMKII和PIAS1进行研究，在流感病毒感染后，细胞层面和动物层面的宿主因子变化以及栀子环烯醚萜苷对流感病毒感染后宿主因子相关功能的影响。. 研究结果显示：流感病毒增殖过程中，NP蛋白和NS1蛋白均与多种宿主因子发生相互作用，过程涉及多条信号通路和宿主功能；我们重点选择的3种宿主因子PACT、CAMKII和PIAS1对流感病毒感染后的病毒增殖、免疫调节以及细胞组织损伤等环节均发挥重要作用；栀子环烯醚萜苷可以通过作用于宿主因子的方式发挥抗流感病毒作用。该研究结果为我们提出的中药通过干预病毒与宿主相互作用，来发挥抑制病毒增殖、提升抗病毒固有免疫功能的作用机制提供实验依据。