流感病毒M2蛋白与宿主蛋白的相互作用及其分子机制研究

Influenza virus is an important zoonotic pathogen. The current application of the anti-influenza drugs in use tends to result in the generation of drug-resistant strains. Thus, it has great significance to study the host proteins required for influenza virus replication for the discovery of new drug targets and the development of new anti-influenza drugs. Influenza virus M2 protein is a multifunctional protein molecule that plays an important role in many aspects of the viral replication cycle. Currently, very few host proteins have been identified to interact with the M2 protein. In previous work in this project, we have successfully established a yeast two hybrid system for the screening of host proteins interacting with the M2 protein, and will further combine the co-immunoprecipitation and mass spectrometry approach to comprehensively screen the host proteins that interact with the M2 protein. On this basis, we will employ the associated functional studies to determine the role of host proteins on influenza virus replication, to elucidate the key steps that host proteins exert their roles in the viral replication cycle, and to reveal the impact of host proteins on influenza virus biological characteristics such as infectivity and pathogenicity. The implementation of this project will deepen the scientific understanding on the molecular mechanisms of host protein functions in the regulation of influenza virus replication cycle, and will provide new thoughts and new targets for the treatment of influenza.

流感病毒是重要的人畜共患传染病病原，目前应用的抗流感病毒药物在使用过程中易于导致耐药性毒株的产生。因此，研究流感病毒复制过程中需要的宿主蛋白，对发现新的药物靶标和研制新型抗流感病毒药物具有十分重要的意义。流感病毒的M2蛋白是一个多功能的蛋白分子，在病毒复制周期的多个环节发挥重要作用，目前鉴定的与M2蛋白相互作用的宿主蛋白仍为数甚少。本课题在前期工作中已经成功建立了筛选与M2蛋白相互作用宿主蛋白的酵母双杂交系统，拟进一步结合运用免疫共沉淀及质谱鉴定的方法全面筛选与M2蛋白相互作用的宿主蛋白。在此基础上，结合相关的功能研究确定宿主蛋白对流感病毒复制发挥的作用，阐明宿主蛋白在病毒复制周期中发挥作用的关键环节，揭示宿主蛋白对流感病毒感染性和致病性等生物学特性的影响。本项目的实施将深化对宿主蛋白参与流感病毒复制周期调控分子机制的科学认知，同时也为流感病毒的药物治疗提供新思路和新靶点。

流感病毒的M2蛋白是一个多功能的蛋白分子，在病毒复制周期的多个环节发挥重要作用，但其作用的发挥离不开大量宿主蛋白的参与，同时M2蛋白也是宿主抗病毒限制性因子的靶标。我们利用酵母双杂交系统筛选到多个与流感病毒M2蛋白互作的新的宿主蛋白，针对其中的三个宿主蛋白进行深入研究。.. 所筛选到的与M2蛋白互作的宿主蛋白之一为转运蛋白粒子复合物的6A亚基（TRAPPC6A）。我们的研究发现TRAPPC6A及其N端内部缺失异构体TRAPPC6A∆均同M2蛋白存在互作，而且M2蛋白的96位亮氨酸对其与TRAPPC6A/TRAPPC6A△的互作发挥决定作用。siRNA干扰下调A549细胞内源性TRAPPC6A△表达后发现流感病毒的复制滴度下降，而且M2蛋白失去与TRAPPC6A△互作能力的突变病毒与野生型病毒相比复制滴度降低，对小鼠致病力下降，表明TRAPPC6A△对流感病毒复制发挥正调控作用。激光共聚焦试验发现，M2蛋白与TRAPPC6A△在病毒感染过程中在细胞质内呈点状聚积，而且两者在点状聚积处共定位。流式细胞技术分析表明，TRAPPC6A△可以延缓M2蛋白沿蛋白分泌通路向细胞质膜出芽位点的运输，进而对病毒复制发挥正调控作用。.. 另一个筛选到的与M2蛋白互作的宿主蛋白为小谷氨酰胺三角四肽重复区蛋白α（SGTA）。通过Co-IP实验，我们发现SGTA蛋白91-313位氨基酸是同M2蛋白互作的关键区域，而M2蛋白的跨膜区及胞质尾区则是与SGTA蛋白发生互作的关键区域。SGTA表达上调后，可以促进流感病毒复制，而SGTA表达下调后则抑制病毒复制。进一步研究表明SGTA蛋白通过与M2蛋白互作，抑制M2蛋白通过蛋白酶体途径降解，对M2蛋白起稳定作用，从而正向调控流感病毒复制。.. 我们还筛选到了同A型流感病毒M2蛋白互作的宿主蛋白过氧化物酶体生物合成因子19（PEX19）。Co-IP实验发现M2蛋白C端的胞质尾区是同PEX19蛋白互作的关键区域。通过利用PEX19蛋白的过表达及敲除细胞系进行病毒感染实验，发现PEX19蛋白对流感病毒复制具有负调控作用，且对不同亚型流感病毒的调控作用具有普遍性。.. 通过该项目的实施，丰富了与流感病毒M2蛋白互作的宿主蛋白网络，进一步深化了我们对于宿主蛋白参与流感病毒复制调控机制的认知。