栀子活性成分干预甲型H1N1流感病毒增殖过程中RNA聚合酶与宿主因子相互作用的研究

Influenza has been a serious threat to human health.In preventing and controling the spread of flu, Traditional Chinese medicine(TCM) has unique advantages such as evident efficacy, little side effect, relative broad-spectrum and difficult to induce resistance.These advantages may relate with virus-host interaction during virus replication. In this project,we will investigate the RNA polymerase interacting with host factors and activating PKR pathway during virus replication of influenza virus A/FM/1/47 (H1N1)and influenza virus A/Virginia/2009. Real time RT-PCR, western blotting, siRNA interfering,minigenome assay and yeast two-hybrid (Y2H) and Co- Immunoprecipitation(Co-IP) technology will be used to observe the interference effect of active components from Gardeniae Fructus on the interaction of influenza virus polymerase and host factor PRKRA at the level of organ-cell-genome-molecular. This study will provide experimental evidence for the mechanism of influenza virus replication and the discovery of novel potential targets for anti-virus.Futhermore, the results will reveal the biological mechanism of traditional Chinese medicine prevent and control the spread of flu on the basis of virus-host interaction.

流感一直严重威胁人类健康,中医药在防治流感上具有"疗效确切、副作用小、相对广谱、不易耐药"的优势和特点,其作用机制可能与病毒和宿主的相互作用环节有关。本项目以病毒增殖过程中宿主天然免疫反应的重要通路-PKR为切入点，以甲型H1N1流感病毒FM1株和Virginia2009株为研究对象，采用real time RT-PCR、western blotting、siRNA干扰、荧光素酶报告基因分析、酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，从整体、细胞、基因、分子水平，观察栀子活性成分对流感病毒RNA聚合酶和宿主因子PRKRA发生相互作用并激活PKR信号途径的影响，为明确流感病毒增殖的作用机理和寻找新的抗病毒靶标提供实验依据，为从病毒与宿主相互作用环节解释中医药防治流感的内在生物学机制提供新思路，为研发新型抗病毒中药提供示范研究。

流感一直严重威胁人类健康，中医药在防治流感上具有“疗效确切、副作用小、相对广谱、不易耐药”的优势和特点，其作用机制可能与病毒和宿主的相互作用环节有关。本项目以病毒增殖过程中宿主天然免疫反应的重要通路-PKR为切入点，以甲型H1N1流感病毒FM1株为研究对象，采用real time RT-PCR、western blotting、siRNA干扰、双荧光素酶报告基因分析等技术，观察栀子活性成分对流感病毒RNA聚合酶与宿主因子PRKRA（PACT）发生相互作用并激活PKR信号途径的影响；并同时观察了对流感病毒RNA聚合酶与宿主因子CAMKII发生相互作用并对钙离子相关信号通路的影响。.研究结果显示甲型流感病毒感染12、24、36、48h后，宿主因子PACT蛋白表达量及其通路的转录因子eIF2α蛋白磷酸化表达均明显升高；栀子活性成分对甲型流感病毒的增殖具有明显的抑制作用；栀子活性成分不同剂量对PACT蛋白表达量和eIF2α蛋白磷酸化表达均呈现不同程度的抑制作用。甲型流感病毒感染12、24、36、48h后，宿主因子CAMKII蛋白表达量均明显降低；其通路蛋白CREB及转录因子c-fos蛋白的表达量均明显升高。栀子活性成分不同剂量对流感病毒感染后PACT蛋白表达量和eIF2α蛋白磷酸化表达的升高均呈现不同程度的抑制作用，与模型对照组比较具有显著性差异；栀子活性成分不同剂量对流感病毒感染后钙离子内流具有明显的抑制作用；栀子活性成分不同剂量对流感病毒感染后宿主因子CAMKII蛋白表达量的降低具有明显的提升作用，对CAMKII信号通路蛋白CREB及转录因子c-fos蛋白表达量的升高具有明显的抑制作用。宿主因子PACT蛋白基因沉默前后，栀子活性成分对流感病毒RNA聚合酶活性均呈现明显的抑制作用；PACT沉默后，其抑制作用更加明显，沉默前后两组相比具有显著性差异；宿主因子CaMKII蛋白基因沉默前后，栀子活性成分对流感RNA聚合酶活性均呈现明显的抑制作用。.本研究为明确流感病毒增殖的作用机理和寻找新的抗病毒靶标提供实验依据，为从病毒与宿主相互作用环节解释中医药防治流感的内在生物学机制提供新思路，为研发新型抗病毒中药提供示范研究。