新型抑菌物质7,8-(2'',2''-二甲基吡喃)芹菜素的生物合成与酶催化机制研究

Exploring novel, safe and efficient preservatives are important for fruit quality preservation. In our previous work, atalantoflavone (7,8-(2'',2''-dimethylpyrano)apigenin) was isolated from morus leaf, a vegetable. This chemical could effectively inhibit the microbes proliferation on banana. Due to limited abundance in nature and complex synthesis process, it is required to develop a biological synthesis technique for atalantoflavone. In this work, a prenyltransferase and a prenyl cyclase will be overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. They can use apigenin as the substrate to synthesize 8-C-prenylapigenin and atalantoflavone sequentially. The active center and catalytic mechanism of both enzymes will be investigated. The structure-antimicrobial activity relationship of atalantoflavone will be revealed. The results will supply new information for synthesis and exploration of fruit preservatives, and will extend the knowledge in fruit storage and preservation.

发掘新型安全高效的保鲜物质是水果贮运保鲜领域重点研究方向，对于水果产业可持续发展具有重要意义。我们前期从蔬菜桑叶中发现了一种可高效抑制香蕉微生物病害的异戊烯基黄酮类物质，即7,8-(2'',2''-二甲基吡喃)芹菜素。由于天然产量有限，化学合成繁琐，需要开展人工生物合成应用基础研究。因此，本项目将前期工作中筛选得到的异戊烯基转移酶基因与异戊烯基环化酶基因同时转入微生物宿主细胞重组表达，以芹菜素为底物，第一步合成8-C-异戊烯基芹菜素，再进一步合成7,8-(2'',2''-二甲基吡喃)芹菜素，构建该物质的微生物合成途径。重点研究异戊烯基转移酶与异戊烯基环化酶的活性位点与催化机制，以及7,8-(2'',2''-二甲基吡喃)芹菜素抑菌活性的构效关系。本研究内容涉及食品科学与合成生物学，研究结果将为果蔬保鲜物质的合成和发掘研究提供新思路，有助于丰富果蔬贮藏保鲜方向基础理论。

在本团队的前期研究工作中，从桑科食用植物中发现了结构独特的食品功能因子7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素，具有良好的生物活性与安全性。由于该物质的天然资源稀缺，需要研究人工合成技术。因此，本项目特围绕7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素的异源生物合成技术开展研究，发掘异戊烯基转移酶与异戊烯基环化酶基因，转化至微生物宿主，实现由芹菜素到7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素的合成，并明确7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素的抑菌活性构效关系。通过研究，取得以下结果：（1）异戊烯基转移酶 FoPT2可成功催化芹菜素合成异戊烯基芹菜素，催化机制为钙离子位于谷氨酸与DMAPP之间，参与焦磷酸的断裂与异戊烯基碳正离子的形成。底物芹菜素与谷氨酸形成氢键，多个氨基酸残基通过疏水键固定芹菜素，导致空间上芹菜素的A环与DMAPP高度接近，发生加成反应，生成C-异戊烯基化芹菜素；（2）AhPC1可成功催化异戊烯基芹菜素环氧化生成7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素。该酶共价结合辅助因子FAD，414位的天门冬氨酸的羧基攻击异戊烯基芹菜素C-7位的羟基，导致羰基形成；而FAD的N攻击异戊烯基的C-1位氢原子，导致烯键形成。羰基氧亲核攻击异戊烯基C-3，直接连接形成六元环状结构。还原态FAD通过氧气参与反应，恢复成氧化态FAD，同时生成过氧化氢；（3）同时将FoPT2与AhPC1转化到酿酒酵母宿主细胞中，在诱导酶表达后直接添加底物芹菜素，最终生成了7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素，发酵时间为36 h，过长会导致产物降解；（4）7,8-(2’’,2’’-二甲基吡喃)芹菜素具备良好的抑菌活性，C-8位被异戊烯基取代可有效提升抑菌活性。然而，8-异戊烯基与7-羟基的环化会导致抑菌活性下降。上述研究结果丰富了功能食品学基础理论，为异戊烯基黄酮类物质的异源生物合成技术提供了科学依据。