木糖高效转化PHA双菌体系的构建及其协同作用机制研究

This project aims at scientific design and rational construction of an artificial microbial consortium formed by two microbes using biological methods, to achieve high-efficient biotransformation from xylose which is non-food material and abundant in natural to polyhydroxyalkanoates (PHA), which are biodegradale bioplastics. This project adopts bottom-up method, that is "genes-modules-cells-systems", developing research on: (1)exploration of functional and assistant genes for xylose utilization and PHA prodution; (2)design, synthesis and assembly of functional and assistant modules; (3)import of modules into different chassis cells and chassises optimization; (4)adaption and regulation between cells of the community. By solving the key problems such as: the synergistic effect mechanism of the microbial consortia, symplastic growth control of the two strains under restrictive conditions, we will obtain the artificial microbial consortium that take xylose as the sole carbon source and convert xylose to PHA with high-efficiency for the first time. The design priciple, construction method and regulation mechanism of our artificial microbial consortium are to be illuminated based on the metabolite exchange between cells and energy level adjust within cells; at the same time, new ideas and new methods are provided for high-efficient biotransformation from non-food materials to other value-added products.

本项目拟采用合成生物学方法，科学设计和理性构建由两种微生物合成细胞组成的人工双菌体系，以自然界储量丰富的非粮原料木糖为底物，实现其高效生物转化为可降解生物塑料PHA。项目研究遵循“基因—模块—细胞—系统”自下而上、逐级递进的思路和方法，分别开展：（1）木糖利用与PHA合成功能基因与辅助基因的挖掘；（2）功能模块与辅助模块的设计合成与组装；（3）不同底盘细胞的模块导入与优化；（4）人工双菌体系细胞间的适配与调控等研究。通过解决双菌体系协同作用机制、限制性条件下双菌协同生长等人工双菌体系高效运作的关键科学问题，首次获得能够利用木糖为唯一碳源高效转化PHA的人工微生物混合菌群，并阐明基于细胞间代谢物质交流和细胞内能量水平调节的人工双菌体系的设计原理、构建方法及其调控机制，同时为非粮原料高效生物转化其他高附加值生物产品提供新思路和新方法。

本项目采用合成生物学的方法，遵循“基因—模块—细胞—系统”自下而上、逐级递进的研究方法，基于天然混菌体系的分析研究，组建功能模块，科学理性的构建出多种人工双菌体系，基本实现木糖高效生物转化PHA。研究过程依次开展：①对木糖产PHA天然混菌体系进行研究分析，筛选出木糖利用基因（XR, XHD）和PHA合成基因（phaA, phaB, phaC），构建功能模块（木糖代谢模块，PHA合成模块）。②初步构建了S. cerevisiae SyBE006-P. putida TU02人工双菌体系，在优化发酵条件下代谢木糖生产PHA，产量为0.37g/L。③构建和优化S. cerevisiae SyBE_Sc01020078-P. putida NBRC 14164人工双菌体系，解除底盘细胞间底物竞争，绘制两菌物质代谢交流设想图；优化发酵条件，在底物中加入辛酸钠前体，双菌体系木糖利用率提高到50%。④构建了以甘油为底物的多个人工双菌体系（E. coli MG1655-P. putida KT2440，E. coli BL21-P. putida KT2440，S. cerevisiae W303-P. putida KT2440），其中E. coli BL21-P. putida KT2440人工双菌体系在加入辛酸钠前体和优化发酵条件下，scl-PHA产量最高达4.81g/L。⑤构建了E. coli MG1655-P. putida KT2440人工双菌体系，乙酸是主要的菌间代谢交流物，调节E. coli MG1655的ATP合成通路，提高了菌体乙酸分泌量；强化表达P. putida KT2440的乙酸利用基因，提高了菌体乙酸利用能力；最终形成“营养-解毒”两菌互利共生关系，以葡萄糖和木糖为底物高效协作生产mcl-PHA，产量为0.541g/L，达到到国际先进水平。在上述研究过程中，初步建立了PHA合成人工双菌体系功能模块的构建方法，阐明了人工双菌体系的菌间关系构建原则及其合作机制，获得了人工双菌体系的设计原理、构建方法及其优化调控策略。