木糖异构酶在酿酒酵母中高效转化木糖的适配性分子机制研究

Xylose isomerase (XI) directly isomerizes xylose to xylulose without assistance of coenzymes so that to build the XI pathway in Saccharomyces cerevisiae is seen as the key to efficient xylose metabolism. However, it is a puzzle that the various XIs were cloned and expressed in S. cerevisiae by many research group, but detected only negligible or no XI activities. After years of efforts, several XIs,with our own proprietary intellectual property rights, were cloned and functional expressed in S.cerevisiae,respectively.Thereinto, not only low ( such as the Sc-xylA form Rumen Sorangium cellulosum, CN.200810138563.1) but also high ( such as the Ru-xylA from rumen metagenome , CN.201110042170.2; PCT/CN2011/001014) activities were gotten in recombinant S.cerevisiae. Further adaptive evolution doubled the Ru-XI activities in the multiple modified S. cerevisiae strain, however,there is no any DNA sequence mutation in the XI's expression cassettes (promoter-ORF-terminator). Base on these previous results , in the present work, the protein-host matching molecular mechanism for high XI activity and effective xylose metabolism will be investigated systematacially, including the structure characteristic of XIs, the genetic characteristic of host S. cerevisiae strains for the higher XI activities and for high efficiency xylose metabolism. The genomics and transcriptomic technology will be used in the present work. The knowledge we get will contribute to develop the technologies using in S.cerevisiae as the cell factories for biomass cellulose conversion.

木糖异构酶(XI)直接异构木糖为木酮糖，无需辅酶参与，是建立木糖转化的首选途径，但一直以来的结果显示XI基因(xylA)在酿酒酵母中高活性表达困难,令人困惑。多年努力下，课题组得到具有自主知识产权的，在酿酒酵母中高活性的Ru-xylA(201110042170.2;PCT/CN 2011/001014)及低活性的Sc-xylA（200810138563.1）；同时得到XI的酶活性明显提高、而引入的xylA表达框(启动子-ORF-终止子)序列没有发生任何突变的进化菌株。在此基础上，本项目通过不同表达系统的纯酶活性及结构差异分析，研究木糖异构酶ORF序列与酿酒酵母中高酶活性表达的适配机制；对进化前后菌株基因组、转录组学差异特征的分析，结合XI的结构特征，系统揭示酿酒酵母活性表达异源XI与木糖高效转化的适配机制。研究成果将有力推动酿酒酵母作为利用木质纤维素为原料的细胞工厂的改良及相关技术进步。

木糖异构酶(XI)直接异构木糖为木酮糖，无需辅酶参与，是建立木糖转化的首选途径，但一直以来的结果显示 XI 基因(xylA)在酿酒酵母中高活性表达困难,令人困惑。多年努力下，课题组得到具有自主知识产权的，在酿酒酵母中高活性的 Ru-xylA(201110042170.2;PCT/CN 2011/001014)及低活性的Sc-xylA（ZL200810138563.1）；同时得到 XI 的酶活性明显提高、而引入的 xylA 表达框(启动子-ORF-终止子)序列没有发生任何突变的进化菌株。在此基础上，根据计划本项目通过分析不同来源的木糖异构酶的差异表达，结合对木糖异构酶活性不同的进化前后菌株的基因组测序、遗传学分析以及进一步的转录组分析以及蛋白特性分析，揭示了木糖异构酶在酿酒酵母中高活性表达的关键机理。研究通过分析进化前后菌株的基因组的差异，获得了一系列突变基因，并通过敲除及超表达策略，以及分析在木糖上的生长的情况，从这些突变基因中获得了一个转录调控因子Ask10p的点突变以及敲除，可以显著提高木糖的利用能力以及木糖异构酶的活性。进一步对点突变以及敲除菌株的转录组分析发现，Ask10p的突变是通过上调分子伴侣，促进木糖异构酶的折叠，进而影响了其活性的。该研究揭示了早期研究中木糖异构酶难以获得活性表达，可能是由于蛋白的错误折叠、高级结构不能正确形成等原因造成的。研究结果对于促进异源蛋白特别是一些细菌来源的蛋白在酿酒酵母中的活性表达具有重要的指导意义。此外，该研究也为高效木糖代谢酿酒酵母菌株的构建提供了新的代谢工程改造的靶标，为二代燃料乙醇生产的机理问题的揭示起到了促进作用。