斯氏艾美耳球虫MIC5与兔胆管上皮细胞互作机制研究

In order to reveal the mechanism of interaction of Eimeria stiedai microneme protein 5(EsMIC5) and the proteins of rabbit liver bile duct epithelial cells, in this study, using yeast two hybrid system,several kinds of target proteins that interacted with EsMIC5 will be screened from the cDNA library of rabbit bile duct epithelial cells by EsMIC5 gene.The extracellular interaction of proteins will be verified by using GST-pull down technology,while the intracellular interaction of proteins will be verified by using co-immunopre-cipitation（Co-IP）technology in 293T cells.Rabbit bile duct epithelial cells that were transfected by eukaryotic expression plasmid carrying EGFP signal of target protein will be cultured,and the target protein will be localized in the host cells by immunofluorescence technique.Finally,the function of protein interaction will be verified by competitive ELISA in which target protein as antigen, the anti-target protein McAb and EsMIC5 containing GFP protein as competitive ligands.By the above experiments,the mechanism of interaction of EsMIC5 and rabbit bile duct epithelial cells will be further revealed, and it will provide theoretical and experimental basis for the development of gene engineering preparation that can block the adhesion of MIC5 and host cell , control the infection and popular of E.stiedai.

为揭示兔斯氏艾美尔球虫微线蛋白5与兔肝胆管上皮细胞的作用机理，本研究在构建含GAD的酵母双杂交兔肝胆管上皮细胞cDNA文库的基础上，以EsMIC5基因为诱饵，采用分子克隆方法构建含GBD的EsMIC5基因真核表达质粒，通过酵母双杂交系统从文库中初步筛选出与EsMIC5互作的兔胆管上皮细胞蛋白成分；运用GST-pull down技术进行蛋白互作的胞外验证、运用免疫共沉淀技术在293T细胞内验证蛋白互作；将携带GFP信号的目标蛋白真核表达质粒转染兔胆管上皮细胞，通过检测培养细胞的GFP荧光信号，在宿主细胞中定位目标蛋白；最后以目标蛋白为抗原、相应的McAb和含GFP蛋白的EsMIC5为竞争配体，通过竞争ELISA进行蛋白互作的功能验证，以期深入解析EsMIC5与兔胆管上皮细胞的作用机制，为进一步研制阻断MIC5与宿主黏附的基因工程制剂、控制E.stiedai感染和流行提供理论和试验依据。

兔斯氏艾美尔球虫（Eimeria stiedai，E.stiedai）是唯一一种嗜肝寄生原虫，在我国乃至全世界的兔场中感染率极高，常导致幼兔70%的死亡率、成兔发育不良，是新疆养兔业主要的致死性病原。长期以来，该病主要依靠药物防治，但即使在使用药物的情况下，兔群仍有90%左右的感染率，说明生产中已出现耐药虫株；药物预防还会导致兔产品药物残留问题，因而亟需寻求其它方法控制其感染和流行，基因工程疫苗无疑是最佳选择。微线蛋白（microneme proteins，MICs）是顶复门原虫特有的组分，在介导其黏附宿主细胞和在胞内移行过程中发挥了重要作用，若阻断MICs与宿主的黏附，也就避免了虫体对机体的危害；与其他艾美耳球虫相比，E.stiedai并无特殊的亚细胞结构，其入侵肝细胞必有其异于其它球虫的分子机理，但这方面的研究较为滞后。本项目拟以E.stiedai 微线蛋白5（EsMIC5）为诱饵，采用蛋白互作实验技术和ELISA、免疫荧光技术，筛选、验证、定位与其互作的肝胆管上皮细胞蛋白成分，深入解析其与宿主的黏附机理，进而为研制相应的基因工程制剂奠定理论基础。.经过四年的研究，项目完成了E.stiedai MIC-5基因系列原核和真核表达载体pGBKT7-MIC5、pGEX4T-1-MIC5、pET28a-EGFP-MIC5、pCDNA3.1-flag-MIC5的构建，并在哺乳动物细胞中表达、纯化了E.stiedai MIC5蛋白；采用基于SPR表面等离子共振技术，对兔肝胆管上皮细胞及兔肠黏膜上皮细胞裂解液中与E.stiedai MIC-5蛋白的可能性互作靶标蛋白进行了体外高通量初步筛选，共筛选出源于肝胆管上皮细胞的蛋白有59种、源于兔肠黏膜上皮细胞的蛋白共60种，其中仅源于肝胆管上皮细胞的蛋白有13种；成功构建了兔肝胆管上皮细胞及兔肠黏膜上皮细胞的酵母双杂交cDNA文库，并用诱饵pGBKT7-MIC5对文库进行了筛选，初步筛选出一些目标序列，但测序表明结果均为非兔源蛋白基因序列，后期进行了进一步验证性实验，但依然没有获得有价值的目标序列。