共表达E.stiedai MIC-5和RHDV VP60重组痘苗病毒构建及免疫机制研究

为获得同时预防兔斯氏艾美尔球虫（E.stiedai）和兔病毒性出血症（RHD）的二价痘苗病毒疫苗，本研究采用SMART RACE、RT-PCR及分子克隆技术分别构建E.stiedai MIC-5和RHDV VP60基因转移载体，并将上述两种目的片段顺次克隆至含痘苗病毒TK基因同源臂、早晚期启动子P7.5以及晚期启动子P11启动的LacZ基因的转染质粒中，通过同源重组从Hela细胞中获取共表达MIC-5和VP60基因的重组痘苗病毒；将此重组病毒感染Hela细胞和兔，获取重组抗原和抗体，用Western blot分析重组蛋白的反应原性，通过测定免疫抗体及T细胞亚群的动态变化、比较重组病毒与自然流行毒（虫）株单独感染的免疫保护力差异，揭示重组病毒的免疫保护机制，为E.stiedai和RHDV重组免疫制剂的研制及多外源基因重组痘苗病毒的改造和优化奠定试验和理论基础。

兔斯氏艾美尔球虫（Eimeria stiedai，E.stiedai）和病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）均以肝脏为靶器官，且均严重危害养兔业，现阶段的防控手段尚有诸多不足，亟需寻求生物学手段控制二者的感染和流行。E.stiedai的微线蛋白（microneme protein，MIC），尤其是MIC5，在介导其黏附宿主细胞和在胞内移行过程中发挥了重要作用；RHDV的结构蛋白VP60能诱导机体的体液免疫和细胞免疫；本项目即以E.stiedai MIC5和RHDV VP60为研究对象，构建重组腺病毒，揭示重组病毒的免疫保护规律，为重组病毒的改造和优化及E.stiedai 和RHDV重组免疫制剂的研制奠定基础。. 经过四年的研究，项目揭示了E.stiedai阿拉尔株的最小潜在期、卵囊发育、卵囊大小及指数、卵囊产量高峰、致病性等基本生物学特性，显示其有一定的地域特性；对染虫动物内脏中的E.stiedai抗原进行了免疫组化定位。. 采用Gateway技术分别构建了E.stiedai孢子化卵囊cDNA原核和慢病毒表达文库，并测定了文库质量；从原核表达文库中扩增出了E.stiedai MIC5部分基因序列，并表达、纯化了相应的蛋白多肽。文库质量分析表明，未经扩增的原始慢病毒表达文库容量为3.5×10^6 CFU/ml，原核表达文库容量为3.9×10^6 CFU/ml，平均插入片段大小1.5kb，重组率100%；获得的E.stiedai MIC5部分基因序列长552bp，与参考序列的同源性高达99%；经原核融合表达、纯化，获得约46KD的融合蛋白。目的蛋白含3个由半胱氨酸序列构成的Apple结构域，揭示其与粘附和入侵宿主细胞相关，但其稳定性不足可能会影响其免疫原性。. 利用PCR方法从E.stiedai孢子化卵囊cDNA文库中钓出MIC5基因、从含RHDV病料中获取VP60基因，构建pYr-ads-1-VP60-MIC5-FLAG表达载体；利用重组腺病毒构建系统，获取重组质粒pAd-1-VP60-MIC5-FLAG，并将其和腺病毒共转染293A细胞，成功构建了共表达E.stiedai MIC5和RHDV VP60的重组腺病毒，为进一步研究其免疫机制、研制相应的免疫制剂奠定了基础。