NK细胞颗粒酶H清除乙肝病毒机制的研究

细胞毒性效应细胞(NK、CTL)中的毒性颗粒体途径在机体抗病毒作用中发挥重要的作用。毒性颗粒体中的颗粒酶H是一种类糜蛋白酶，本实验室已初步阐明颗粒酶H的抗肿瘤机制并解析了其结构。乙肝是由乙肝病毒（HBV）引起的传染病，广泛流行于世界各国，在中国尤为突出。HBx是由HBV的x开放阅读框（ORF）编码的多功能蛋白质，在病毒感染中发挥重要的作用。最近我们首次发现人类五种颗粒酶中，颗粒酶H能最为有效地通过切割HBx抑制HBV的复制，并不会引起肝细胞的死亡，并且发现乙肝携带者血液中的颗粒酶H含量远低于正常人。本研究将继续深入研究颗粒酶H在颗粒体介导的抑制HBV乙肝病毒中的作用；并通过HBV感染小鼠模型及建立颗粒酶H转基因小鼠模型在动物层面验证颗粒酶H在清除HBV病毒中的作用；深入分析HBV病毒与颗粒酶H的临床相关性，为该疾病的治疗提供新的可能策略打好基础并加深对NK细胞抗病毒感染机理的认识。

肿瘤杀伤蛋白颗粒酶介导的靶细胞凋亡是机体抗病毒和抗肿瘤的主要免疫效应途径。我们发现细胞毒性颗粒途径可以抑制HBV的复制，并且这种抑制不依赖于被感染细胞的死亡。发现颗粒酶H是细胞毒性颗粒途径用来抑制HBV的有效分子，它可以抑制HBV的复制，而且这种抑制也不依赖于靶细胞的死亡。揭示了颗粒酶H可以在第79位的甲硫氨酸处切割HBx，进而诱导HBx的降解。发现乙肝病毒携带者与HBV所致的肝癌病人体内的颗粒酶H表达量都远远低于正常人，揭示颗粒酶H的低表达与HBV感染正相关。我们表达纯化了具有生物学活性的颗粒酶H，解析了颗粒酶H与底物肽段结合状态下的晶体结构，我们首先发现颗粒酶H第226位甘氨酸决定其识别苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的分子机制。我们设计了颗粒酶H的高效性、特异性抑制剂并解析了酶-抑制剂复合体的晶体结构。我们发现丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINB1和颗粒酶H在自然杀伤细胞的细胞毒性颗粒中有共定位，并证明了SERPINB1能够与颗粒酶H相互作用形成共价复合物。阐明SERPINB1能够抑制颗粒酶H的底物水解活性，并证实颗粒酶H切割SERPINB1的活性中心位点是343位苯丙氨酸。发现高表达SERPINB1的靶细胞能够抑制重组颗粒酶H或者LAK细胞引起的细胞死亡。解析了SERPINB1和活性颗粒酶H的晶体结构，通过docking的方法，展示了颗粒酶H和SERPINB1能形成米氏抑制复合物，揭示了SERPINB1抑制颗粒酶H的结构基础，从结构生物学的角度给我们提供了研究丝氨酸蛋白酶和抑制剂的相互作用的新思路。通过该项目的完成，揭示颗粒酶H发挥免疫效应的结构及机理，加深了对NK细胞抗感染及抗肿瘤机制的认识。