EBV-miR-BART14-3p通过上调肿瘤细胞CCL22表达介导EB病毒相关胃癌免疫逃逸的机制研究

The infiltration of regulatory T cells in tumor microenvironment is associated with tumor development and immune escape in several human cancers. Our previous study have elucidated that Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma (EBVaGC) can recruit Tregs through secreting CCL22, thus escaping from immune attack. The NF- kappa B signaling pathway is crucial in CCL22 expression in EBVaGC, but the activation mechanism of this pathway is largely unknown. EBV miRNAs can regulate both viral and cellular targets and thus contribute to.immune evasion. Our preliminary study found that the expression of EBV-miR-BART14-3p was increased in EBVaGC cells; there was target sequence of BART14-3p in mRNA 3’-UTR (untranslated regions) of CYLD, a key inhibitor of NF-kappa B pathway; and BART14-3p could down-regulate the activity of luciferase report gene of CYLD. In this study, we tried to investigate the influences of BART14-3p on CYLD and NF-kappa B pathway; to observe the impact of EBV-miRNA on EBVaGC tumor cells-mediated immunosuppression; and to explore the correlation between the EBV-miRNA expression and the clinical pathological features and prognosis of the EBVaGC patients. The major goal of this work is to investigate the contribution of EBV-miRNA to CCL22 production and Tregs recruitment in tumor microenvironment, in the hope of providing some scientific basis for clinical treatment of EBVaGC in the future.

肿瘤微环境Tregs增多与肿瘤进展和免疫逃逸密切相关。课题前期发现EBVaGC肿瘤细胞可高表达细胞因子CCL22招募Tregs，促进肿瘤免疫逃逸。NF-κB通路是上调CCL22表达的关键通路，但该通路激活机制未明。EBV-miRs可对病毒和细胞基因表达进行调控，参与肿瘤免疫逃逸，预实验发现：EBV-miR-BART14-3p在EBVaGC肿瘤细胞高表达，且在NF-κB通路负调控蛋白CYLD的mRNA3’-UTR存在靶序列，能下调CYLD荧光素酶报告基因活性。本项目拟从基因表达调控、细胞实验、动物模型及人组织标本四个层面，探讨BART14-3p调控CYLD并活化NF-κB信号通路的分子机制，明确对EBVaGC肿瘤细胞CCL22表达的影响，阐明与EBVaGC临床病理特征和预后的相关性。旨在揭示EBV-miRs上调肿瘤细胞因子表达，介导EBVaGC免疫逃逸的分子机制，为肿瘤免疫治疗奠定基础。

第一部分：世界范围约10%的胃癌与EB病毒感染相关，被称为EB病毒相关胃癌（EBVaGC）。EBV潜伏膜蛋白LMP2A对EBVaGC肿瘤发生及生物学行为有重要影响。我们通过逆转录病毒构建LMP2A稳定转染胃癌细胞株AGS、SGC7901及永生化胃粘膜细胞株GES1，并通过shRNA敲除EBVaGC细胞株YECCL的LMP2A，系统研究了LMP2A对胃癌细胞生长特性、上皮间充质转化及干细胞转化的影响。并探讨了LMP2A对NF-KB通路激活及趋化因子CCL22表达的调控，以期阐明EBVaGC组织中Tregs的增多机制。结果显示LMP2A转染后细胞增殖、迁移、抗凋亡及裸鼠成瘤能力均显著增强，证实LMP2A在胃粘膜恶性转化的重要作用。QRT-PCR显示LMP2A转染不同程度上调间质标记Vimentin、Fibronectin和N-cadherin及EMT相关转录因子Snail、Slug和Zeb1表达，促进EMT的发生。EMT意味着肿瘤细胞粘附下降、骨架改建及极性消失，该结果为阐明LMP2A增强肿瘤迁移和侵袭提供理论支持。流式细胞术检测到LMP2A转染可在蛋白水平上调细胞表面干细胞标记CD44、CD90和CD133，提示LMP2A有助于EBVaGC干细胞特性获得。同时我们证实LMP2A是激活NF-kB通路的重要因子，并继而上调EBVaGC的CCL22表达。以上结果表明，LMP2A转染有助于肿瘤干细胞性获得并可能成为逃逸机体免疫识别和杀伤的关键群体，而肿瘤自身产生的CCL22则可通过募集Tregs建立局部免疫抑制微环境，两种机制可能协同促进EBVaGC免疫逃逸的发生。该研究进一步阐明LMP2A对EBVaGC生物学行为影响及在免疫逃逸中的重要作用，可能为EBVaGC治疗策略提供新的见解。.第二部分：胃癌是世界范围常见恶性肿瘤，多种胃癌预后和风险评估的标志物已被迅速发现。FLAD1是影响细胞周期和存活的重要蛋白，已有研究表明，FLAD1的高表达和多种恶性肿瘤不良预后相关，但关于FLAD1在胃癌组织中的表达情况未见报道。为填补这一空白，我们挖掘了在线数据库，并使用课题组胃癌样本库进行结果验证。结果发现胃癌组织中FLAD1在mRNA和蛋白水平上均有过表达，且FLAD1的高表达与胃癌的总体不良生存率（OS）、首次进展率（FP）和进展后生存率（PPS），可作为胃癌的潜在预后因素。