活体成像引导下的抗CD105免疫脂质体/内皮抑素基因转运系统的抗肺癌新生血管生成研究

In recent years, some antiangiogenic drugs have been used to treat lung cancer, and shown a significantly anti-tumor activity. However, endothelial cells within the tumor microenvironment may be genetic alteration, and long-term use of a single antiangiogenic drug increases local hypoxia, which induces re-growth and metastasis of tumors. Antiangiogenic gene therapy will likely become another potential treatment for lung cancer. The purpose of this study is to investigate an anti-CD105 immunoliposomes for combined in vivo imaging and targeted gene delivery. The system will target to the CD105 on proliferating endothelial cells of tumor vessels for gene therapy through liposome-mediated transfection, with VEGF promoter regulated endostatin gene expression, and dynamic monitoring the course of treatment based on the in vivo imaging technology. In our previous work, an anti-CD105 immnuoliposomes was made, with suitable particle size, homogeneous size distribution, biocompatibility, plasmid DNA entrapped efficiency up to 70 %, good serum stability, in vivo circulation time up to 72 h, and tumor targeting imaging labeled with near-infrared fluorescent dye. In this study, the immnuoliposomes will be used to entrap endostatin gene for targeting tumor microvascular endothelial cells expression, explore the effects of gene therapy in animal models, analyze the gene therapy mechanism and open up new avenues for future image-guided gene delivery and therapy.

近年部分抗血管生成药物已进入肺癌临床治疗并显示出明显的抗肿瘤活性。然而肿瘤微环境可能导致内皮细胞基因型改变及长期单一抗血管药物作用增加局部缺氧致部分肿瘤重新生长和转移。抗肺癌新生血管生成基因治疗成为另一种极具潜力的治疗新策略。本课题拟寻找一种兼具活体成像和基因治疗的抗CD105免疫脂质体基因转运系统。其靶向肿瘤微血管内皮细胞表面特异性标志物CD105，通过脂质体介导转染，借助特异性启动子VEGFP调控内皮抑素基因治疗，并基于活体成像技术动态监测治疗过程。前期已构建抗CD105免疫脂质体，其粒径合适、分布均匀、生物相容性好，包装效率达70 %，血清稳定，体内循环时间达72 h以上，通过近红外荧光染料标记初步实现靶向肿瘤组织成像。选择该免疫脂质体装载目的基因靶向肿瘤微血管内皮细胞特异性表达，探索其在动物模型中的基因治疗效果，分析基因治疗机制，尝试成像引导下的抗血管基因转运和治疗新途径研究。

肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一。近期研究表明抗血管生成治疗有望提高其生存率。本项目通过构建包裹分泌型内皮抑素基因、耦联CD105单抗的免疫脂质体(ILp)进行肿瘤靶向成像和抗血管基因治疗研究。反复优化脂质体的大小、zeta电位、磷脂成分、抗体结合能力和pcDNA包裹能力。通过抗CD-105免疫磁珠法，从肺鳞癌肿瘤组织中分离和培养获得高纯度(>98%)的正常和肿瘤来源的血管内皮细胞(TECs)。体外检测免疫脂质体特异性靶向原代TECs和基因转染能力。体内评估免疫脂质体生物安全性。裸鼠肿瘤异体移植模型检测荧光标记的免疫脂质体的肿瘤组织特异定位和ILp/pcDNA3.1-CSF1- ENDOSTATIN临床治疗潜力。.结果表明，包裹后的ILp是分布均匀的、球形双层膜结构，粒径122 ± 11 nm，zeta电位+1.37 mV。脂质体体内注射后未引起小鼠体重、肝指数、氧化应激或肝、肾功能指标的变化。在体外和体内实验中，抗CD105单抗的耦联使脂质体具备对肿瘤来源内皮细胞的特异性靶向能力。荷瘤小鼠尾静脉注射荧光标记的免疫脂质体0.5h后，免疫脂质体快速在肿瘤组织区域聚集和荧光可视化成像。随着观察时间的进展，小鼠体内的荧光材料逐步清除至信号低于检测值，而肿瘤组织中荧光信号持续稳定至84h，并于60–72h呈现特异性成像。小鼠体内基因治疗实验结果表明，给药处理42d后，单纯抗CD105抗体组肿瘤生长抑制约23%，而包裹pcDNA3.1-CSF1-ENDOSTATIN的免疫脂质体可以运载基因至肿瘤组织，并实现抑制肿瘤生长达70 %。. 因此，本项目建立了一种由PEG包被的、耦联抗CD105单抗，载有pcDNA3.1-CSF1-ENDOSTATIN免疫脂质体用于靶向肿瘤来源内皮细胞基因治疗和肿瘤成像。CD105抗体的耦联有效地提升了脂质体体内外、体内靶向肿瘤血管内皮细胞的能力。该免疫脂质体结合了CD105抗体和分泌型内皮抑素的抗血管能力。后续工作将集中探讨体内成像的精度和灵敏度，成像引导下的基因运载及治疗应用研究。总之，这些数据探讨了抗CD105免疫脂质体的肿瘤成像和基因运载的优势，为进一步发展更高效、安全的肿瘤抗血管治疗方案提供了借鉴。