内皮前体细胞导向内皮抑素基因抗肝癌肿瘤血管生成治疗及其活体监测体系研究

内皮抑素(Endostatin)是活性最强的血管生成抑制因子之一，它可以抑制肿瘤新生血管内皮细胞增殖，阻止瘤组织新生血管形成，从而发挥抑瘤作用。实验证实，内皮前体细胞（EPC）参与肿瘤血管生成，对肿瘤组织有靶向归巢性。超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）有良好的超顺磁性，将SPIO标记EPC后就有可能在活体状态下示踪移植入体内的细胞。本研究拟构建重组腺病毒pAd-CMV-Endostatin，体外转染骨髓EPC后再标记SPIO，将该标记细胞移植入兔肝癌模型，利用EPC的肿瘤组织特异性归巢特性将内皮抑素基因靶向运送至瘤体，探讨EPC导向的内皮抑素基因抑制肝癌肿瘤血管生成的可行性和有效性；采用磁标记MRI示踪技术，在活体、无创、动态追踪植入的基因修饰EPC，探索其活体监测体系。这将有可能为肝癌及其它恶性肿瘤的抗血管生成基因治疗提供新思路和新途径, 并为肿瘤基因治疗提供一种崭新的活体监测手段。

本研究目的为将内皮前体细胞（EPC）转染内皮抑素基因（Endostatin），再以超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）标记后移植入肝癌模型体内，观察EPC导向的Endostatin抑制肝癌肿瘤血管生成的可行性和有效性；同时采用磁共振（MR）成像活体示踪移植的EPC。本项目内容均已按计划完成。采用湿化学共沉淀法及表面包被技术，成功制备了SPIO粒子，表征测定表明该粒子粒径均匀稳定，可用于EPC标记。采用骨髓抽吸和外周血细胞离心法成功获取了兔EPC细胞，对其进行了体外诱导培养和扩增，并通过细胞表型标记物检测以及功能检测鉴定证明获取的细胞为兔EPC细胞。用RT-PCR 法扩增了人Endostatin基因片段，用细菌内同源重组方法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒pAd-CMV- Endostatin，并进行了扩增和鉴定，获得了pAd-CMV- Endostatin体外高效转染EPC的最佳条件。采用SPIO标记了Endostatin基因修饰的EPC（Endostatin-EPC）和未修饰的EPC，获得了SPIO体外标记Endostatin-EPC的最佳条件，检测证明标记对细胞活力及功能无明显影响，同时成功进行了标记细胞的体外MR成像。采用VX2肿瘤细胞悬液接种于兔腿，获得腿部实体肿瘤，然后采用改良肿瘤组织块悬液注入法成功制做了兔肝癌模型。结果表明，模型稳定且成功率高。将SPIO标记的转染了Endostatin基因的EPC（Endostatin-EPC-SPIO），经兔耳缘静脉注入兔肝癌模型体内（1×107个/只），以MR成像在不同时间点动态、活体示踪了移植入兔肝癌模型的细胞，经过将MR成像与对应时间点肝脏肿瘤病理学、免疫组化、分子生物学分析等多种方法对照，发现Endostatin-EPC对肝癌具有定向归巢性，对肿瘤血管生成具有抑制作用；MR成像可以活体动态示踪SPIO标记的Endostatin-EPC，可能成为评价Endostatin-EPC靶向治疗肝癌疗效的重要新方法。本研究为肝癌及其它恶性肿瘤的抗血管生成基因治疗提供了新思路和新途径，并为肿瘤基因治疗提供了一种崭新的活体监测手段。本项目已发表SCI收录论文6篇，1篇论文已发表于SCI收录期刊，待SCI收录。