量子点标记的免疫脂质体定向筛选肺癌血管相关抗原标志物

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肺癌分子生物学研究已取得重大成就，却未能遏制发病率和死亡率的上升，且现有标志物灵敏度低、重复性差等原因，其早期检测和诊断仍是大难题。因此，建立一套完整、有效的标志物筛选、鉴定和评估体系至关重要。血清蛋白质组学与免疫学技术结合，对筛选肿瘤相关抗原及自身抗体的研究有重要意义。载有量子点，靶向肿瘤的免疫脂质体，集成像和靶向于单一纳米颗粒，不仅呈现肿瘤生长可视化过程，与流式细胞术结合更有望改善组织细胞异质性大、样品成分复杂等缺点。结合多种技术优势，基于前期免疫脂质体的构建工作，本课题拟用载有量子点，靶向肿瘤新生血管内皮细胞表面Endoglin的免疫脂质体与蛋白质组学、免疫学技术相结合定向筛选肺癌血管标志物，并深入探讨抗原和血清自身抗体表达量与肿瘤发生、发展、预后的相关性和敏感性，最终获得灵敏度和重复性高的肺癌血管标志物，并为其他恶性肿瘤的研究提供基础和依据。

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。近年针对肿瘤靶向治疗研究至关重要。本项目构建靶向肿瘤新生血管内皮细胞表面Endoglin免疫脂质体和靶向肿瘤细胞的转铁蛋白脂质体。该免疫脂质体(偶联抗体、包裹DNA后约218 nm)和转铁蛋白脂质体(偶联蛋白、包裹DNA后约168 nm)粒径分布均匀，生物相容性高，能携带DNA成功转染原代微血管内皮细胞(效率约35 %)，或多株转铁蛋白受体高表达肿瘤细胞(效率约80 %)。在裸鼠肿瘤模型体内，荧光靶向脂质体体内代谢时间长达72 h，经循环代谢可实现肿瘤组织特异性成像。载有治疗基因的荧光脂质体既能有效抑制肿瘤生长，延长小鼠生存周期，也能进行治疗过程的动态监测。通过磁珠纯化系统从Lewis肺癌模型中分离、培养原代肺来源(NECs)和肿瘤来源微血管内皮细胞(TECs)；通过共聚焦、流式细胞术证实该原代细胞表面表达CD31、VWF、CD105、CD34、CD144等内皮细胞表面分子，其中CD105阳性率高达98±1.2 %。蛋白质组学方法比较NECs和TECs蛋白表达差异，获得63个表达显著差异蛋白点(37个上调，26个下调)。这些蛋白涉及代谢、细胞生长/维持、能量通路、蛋白代谢等生物过程，主要为细胞质、线粒体和细胞核组分，参与细胞骨架维持、酶催化、分子伴侣、热休克蛋白等生物功能。进一步分析蛋白蛋白相互作用，蛋白Vim、Pgk1、Hspd1、Pkm、Pgam1、Pcna、Cct2、Hspa8、Actg1、Prdx1与其他差异蛋白的相互作用最显著。Real-time RT-PCR分析23种差异蛋白的基因表达水平，其中约83 %基因表达不变或与蛋白表达一致；共聚焦、流式验证Hspd1、Pgam1、Pgk1、Tagln2四种肿瘤来源细胞中的表达上调，及Vim表达下调；证实在临床人肺鳞癌标本中蛋白Tagln2、Hspd1、Vim表达趋势与小鼠实验结果一致。借鉴该原代细胞的分离培养方法，目前已经获得高纯度的人肺正常、鳞癌、癌旁来源微血管内皮细胞，以iTraq LC/MS/MS技术结合信息学分析，鉴定出1765个内皮细胞蛋白；结合多种手段证实三者在分子和功能水平的多方面差异，及尝试阐述不同来源微血管内皮细胞在肿瘤血管形成过程中的不同作用。本项目既探索了深入探寻肺癌抗血管生成特异靶点及一条成像引导下的肿瘤靶向纳米治疗策略。