乙肝病毒感染后细胞自噬对I型干扰素作用以及补肾健脾方的干预机制研究

Autophagy is a catabolic process in which lysosomes swallow and degrade cellular components, and could promote hepatitis virus (HBV) replication . Type I interferons (IFN) is the key cytokine inhibiting viral replication. And recent studies show that autophagy can regulate the secretion of type I interferon by RIG-1 signal pathway. Bushenjianpi formula is an effective treatment of chronic hepatitis B, and has been showed that it could inhibit the autophagy caused by HBV infection and reduce the viral replication by regulating the immune. Thus, we propose that Bushenjianpi formula could increase the expression of type Ⅰ interferon by inhibiting the autophagy induced by HBV infection and thereby reduces the level of viral replication. In this study, the Huh7.5 cells transfected pHBV1.3 plasmid are taken as a model to investigate the effect of Bushenjianpi formula on autophagy regulatory proteins（mTOR，ULK1/2，Atg13，FIP2000，Vps34, Beclin1）, Autophagy-related protein formation (Atg12, Atg5, Atg16, Atg3, Atg7) , RIG-1 pathway ,IFN-β ,IFN-α,ISRE promoter and interferon effector proteins, and make clear the immunological mechanisms of Bushenjianpi formula treating chronic hepatitis B.

细胞自噬是一种通过溶酶体吞噬降解自身成分的过程,可以促进乙肝病毒（HBV）复制，I型干扰素是抑制病毒复制的关键细胞因子,近期研究表明细胞自噬可通过RIG-1信号通路调节I型干扰素的分泌。补肾健脾方是治疗慢性乙型肝炎的有效验方，前期研究证实该方可通过抑制HBV感染引起的细胞过度自噬、通过调控免疫抑制病毒复制。由此我们提出：补肾健脾方可通过抑制HBV感染引起的细胞过度自噬，促进Ⅰ型干扰素的表达，从而降低病毒复制水平。本研究以pHBV1.3转染Huh7.5细胞为模型，探讨补肾健脾方对细胞自噬调控蛋白（mTOR，ULK1/2，Atg13，FIP2000，Vps34, Beclin1）、自噬体形成相关蛋白（Atg12，Atg5，Atg16，Atg3，Atg7）、RIG-1诱导干扰素途径、IFN-β 、IFN-α、ISRE启动子、干扰素效应蛋白的影响，进一步明确补肾健脾方治疗慢性乙型肝炎部分免疫机制。

背景：干扰素是抑制病毒复制的关键细胞因子,研究表明细胞自噬可通过RIG-I信号通路调节干扰素的分泌。补肾健脾方(灵猫方)前期研究证实该方可通过抑制乙肝病毒（HBV）引起的细胞自噬，该方可通过调控免疫抑制HBV复制。此课题目的是为证实灵猫方是否通过抑制HBV引起的细胞自噬，增强天然免疫，降低HBV复制。方法：Atg7 siRNA作用于pHBV1.3-pCR2.1转染HepG2，对照组为空载体、Control siRNA，ELISA检测HBsAg、HBeAg，RT-PCR检测 IFN-α、IFN-β、IFN—λ1、OAS3、MxA、 PRKmRNA，Annexin&nbsp;V/PI双染色法检测细胞凋亡，WB检测RIG-I、IPS-1；灵猫方组作用于pHBV1.3-pCR2.1转染HepG2，对照组为空载体、生理盐水，WB检测自噬相关蛋白，WB检测LC3II/LC3I，免疫荧光法检测LC3荧光，电镜检测自噬体，RT-PCR检测 IFN-α、 IFN-β、IFN—λ1 、OAS1、MxA、PRKmRNA，Annexin&nbsp;V/PI双染色法检测细胞凋亡，WB检测RIG-I、IPS-1。结果：Atg7 siRNA作用于pHBV1.3-pCR2.1转染HepG2，与对照组相比，HBsAg、HBeAg、HBVDNA明显下降（P<0.05，P<0.01,P<0.01)，IFN-α、IFN-β、 IFN—λ1、OAS3、 MxA,、PRKmRNA明显升高（P<0.01），早期细胞凋亡增加（P<0.01）；RIG-I、IPS-1蛋白表达无变化；灵猫方作用于pHBV1.3-pCR2.1转染HepG2，细胞Atg7、Beclin 1、Vps34表达下降，LC3II/LC3I蛋白表达比值下降，LC3针尖样荧光减少，抑制自噬体，灵猫方组IFN-α, IFN-β, IFN—λ1、OAS1, MxA, PRKmRNA明显升高（P<0.01），细胞凋亡无变化（P>0.05)，RIG-I、IPS-1表达无变化。结论：HBV感染后，抑制细胞自噬可增强天然免疫，抑制HBV复制，未通过RIG-I信号通路调节干扰素；灵猫方通过抑制Atg7、Beclin 1、Vps34蛋白，抑制细胞自噬，增强天然免疫，抑制HBV复制，未通过RIG-I信号通路调节干扰素；科学意义：明确灵猫方治疗慢性乙型肝炎部分免疫机制。