HSF4功能与白内障发病的分子机制研究

Cataract is the most common cause for vision loss in humans. HSF4 mutations lead to both congenital and age-related cataract. However, the mechanism by which HSF4 mutations cause cataract remains elusive. In the previous studies, we provide the first evidences to show that HSF4 forms constitutive nuclear bodies, organizes p53 distribution, interacts with p53 in the nuclei of human lens epithelial cells; HSF4 inhibits lens epithelial cell proliferation by inhibiting DNA replication; regulates expression of DLAD, which is responsible for denucleation of lens fiber cells; and knockdown of HSF4 expression in zebrafish resulted in cataract-like phenotype in the fish lens. These sets of data lend credence to our hypothesis that HSF4 is a pivotal factor regulating lens differentiation. Here we will perform serials experiments, both in vitro and in vivo, to test this theory. We will investigate HSF4's pivotal role regulating lens differentiation through several mechanisms: First, If HSF4 inhibit lens epithelial cell proliferation and regulate fiber cell differentiation by activating the G1/S checkpoint? Second, how do HSF4 mutations disrupted its regulation in lens structural protein expression? Third, how does HSF4 regulate expression of DLAD and control denucleation of lens fiber cells? In addition, we will design experiments to test if HSF4 exerts the above functions through synergistic action with p53? Our studies will find novel pathway control lens differentiation and development, and for the first time, reveal the molecular mechanisms regarding how HSF4 mutations cause cataract.

白内障是导致人类失明的主要原因，HSF4突变可引起先天性和年龄相关性白内障，但其突变引起白内障的分子病理机制尚不清楚。在前期工作中，我们首先发现HSF4：在细胞核中组成性地形成核内小体，与p53共定位，通过Co-IP和GST pull-down验证了其和p53直接相互作用；抑制DNA复制和细胞增殖；调控细胞核降解关键酶DLAD表达；用morpholino抑制其表达可致斑马鱼产生类似白内障表型。我们认为HSF4在晶状体发育和分化过程中起着调节中枢作用。本项目将在前期工作的基础上，通过体外和体内实验，深入研究HSF4在启动晶状体纤维细胞分化、调控特异结构蛋白表达，以及调控DLAD和纤维细胞去核化的分子机制，揭示HSF4调控晶状体细胞分化和发育过程的中枢作用，以及p53与HSF4的协同调控作用。本项目如顺利实施，不仅有助于理解晶状体细胞分化的精妙调控过程，还可能揭示白内障发病的新的分子病理机制。

白内障是人类致盲的最主要原因之一，导致约50％的人类失明和30％的视力损伤。HSF4是重要的白内障致病基因，可引起先天性白内障和老年性白内障，但HSF4的功能及其突变导致先天性和老年性白内障的分子机制尚不明晰。本项目在国家自然科学基金的支持下，对HSF4在晶状体发育和分化中的作用及其分子机制进行了深入研究，取得系列重要的创新成果：i，发现HSF4调控晶状体细胞的去核。发现HSF4可以结合DLAD的启动子直接调控其转录，进而调控DLAD的核酸酶活性并促进细胞核DNA的降解。在斑马鱼体内用morphilino特异地抑制HSF4的表达后，发现DLAD的表达量下调，晶状体纤维细胞去核异常并呈现类似于白内障表型。ii，首次发现HSF4可以与p53相互作用共同调控晶状体发育和分化。发现HSF4可在细胞核中招募p53，并依赖于p53抑制晶状体上皮细胞增殖，并通过将细胞阻滞于G1/S期而促进其向晶状体纤维细胞分化。我们发现p53蛋白在晶状体上皮细胞中可被泛素化调控，HSF4通过抑制其泛素化降解而在蛋白水平上维持p53的稳定。应用TALEN技术我们成功地构建了HSF4缺陷的斑马鱼模型，通过冰冻切片和免疫荧光分析，发现晶状体上皮细胞的增殖和晶状体纤维细胞的分化均出现异常，呈现典型的白内障表型。在HSF4缺陷型斑马鱼的晶状体中p53表达显著下调，其下游靶基因Caspase3的表达和活性均显著下调，提示HSF4可以通过调控p53来发挥其调节晶状体发育与分化的功能。iii，首次发现转录因子HSF4的调控机制。本课题通过酵母双杂交实验发现HSF4和BCAS2相互作用。BCAS2是mRNA前体剪接复合体中的一个重要组成部分，而我们发现BCAS2可以通过调控HSF4第206位赖氨酸的泛素化修饰，促进HSF4的泛素化降解，从而维持HSF4在晶状体中稳态。我们的研究工作提示HSF4可以依赖于p53，抑制晶状体细胞增殖并促进其向晶状体纤维细胞分化，调控晶状体特异蛋白的表达，以及在晶状体分化的去核化过程中发挥作用，从而在晶状体发育和分化过程中发挥调控中枢作用，这一研究拓展了对于HSF4基因功能和晶状体发育和分化的认识，并为HSF4突变导致白内障的病理机制提供了线索。