腌制过程中高钠离子强度诱导肌球蛋白ATPase失活机制研究

Myosin ATPase activity could catalyze cytoskeletal proteins degradation and myosin proteolysis to form "myofibril fragmentation" in the salting process, which results in the different gel property, water holding capacity and flavor of muscle food. Based on previous data, the high sodium ionic strength will inactive the myosin ATPase in the salting, but the essential mechnism is insufficient. By protein purification, mass spectrum identification, SDS-PAGE，Western blotting, Infrared chromatography and circular dichroism spectra techniques, three researches will be carried out. Firstly, the biological characteristics of essential light chain and regulatory light chain and the effect of Ca2+/Mg2+ ionic strength on myosin ATPase activity is being studied. Secondly, the degradation of essential light chain and regulatory light chain, the activity of myosin light chain kinase and myosin light chain phosphorylation under differential sodium ionic strength will be investigated. Thirdly, the mechanism of myosin ATPase inactivation influenced by myosin conformation is performed. Though the previous experiments, the inactivation mechanism of myosin ATPase induced by high sodium ionic strength will be fully explained, which will supply new theory to the muscle salting process..

肌球蛋白 ATPase在肌肉腌制过程中参与调控肌节"小片化"，促使细胞骨架蛋白有限降解和肌球蛋白适度溶出，进而形成肉食品的凝胶、持水和风味特性。本项目组前期研究表明，高钠离子强度能诱导肌球蛋白ATPase失活，但具体机制目前尚不清楚。本项目拟借助蛋白质纯化与鉴定、电泳与印迹、红外光谱与圆二色谱等技术，系统研究肌肉腌制过程中肌球蛋白调节轻链、必需轻链含量、比例和Ca2+/Mg2+强度对肌球蛋白ATPase活性的作用；不同钠离子强度导致调节轻链、必需轻链降解与轻链磷酸激酶钝化与肌球蛋白ATPase失活的本质联系；钠离子改变肌球蛋白重链S1构象对肌球蛋白ATPase活性的作用。以上研究可以揭示出肌肉腌制过程中高钠离子强度诱导肌球蛋白ATPase失活的机制，最终为丰富和发展肌肉的腌制机制提供新的理论参考。

借助蛋白质纯化与鉴定、电泳与印迹、圆二色谱等技术，研究肌肉腌制过程中肌球蛋白轻链含量、Na+/Ca2+/Mg2+对肌球蛋白ATPase活性的作用；不同钠离子强度与肌球蛋白ATPase失活的关系；钠离子改变肌球蛋白重链二级结构对肌球蛋白ATPase活性的作用，初步揭示了肌肉腌制过程中高钠离子强度诱导肌球蛋白ATPase失活的机制，结果如下：.（1）提取了高纯度肌球蛋白，采用1/400（w/w）胰凝乳蛋白酶酶切得到肌球蛋白重链S1，1/1000（w/w）酶切得到肌球蛋白轻链LMM，为肌球蛋白构象变化及肌球蛋白ATPase活性作用机理提供了物质基础。.（2）构建肌肉原位模型和肌球蛋白离体模型，分析证实肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平与肌动球蛋白ATPase活性负相关（r=-0.522），肌球蛋白调节轻链磷酸化水平和肌动球蛋白解离程度呈高度的负相关（r=-0.823）。.（3）采用氯化钠、氯化钙、氯化镁处理背最长肌（Ⅱb型纤维肌肉）和半膜肌（Ⅰ型纤维肌肉），测定不同处理组的肌球蛋白ATPase活性和肌球蛋白的变性程度。结果表明Na+对肌球蛋白ATPase的活性具有抑制作用，DSC的结果证实氯化钠使肌球蛋白变性进而导致肌球蛋白ATPase失活； Ca2+和Mg2+对蛋白质在高盐浓度（5%氯化钠）变性有防御作用。.（4）用不同浓度的氯化钠作用肌球蛋白溶液，分析肌动球蛋白解离、肌球蛋白ATPase活性和蛋白质二级结构，结果表明0.1M～0.4 M NaCl对肌球蛋白聚合体的影响最显著，即0.1 M～0.4 M NaCl影响肌球蛋白ATPase活性较显著；0.1和0.3 M时，肌球蛋白ATPase的活性显著下降（P < 0.05），0.3-0.5 M时，肌球蛋白 ATPase的活性变化不明显（P > 0.05）；随着氯化钠浓度的升高，圆二光谱中196-203 nm和204-240 nm光谱处有规律的向高峰偏移，肌球蛋白S1端a-螺旋结构相对增多，改变其二级结构影响酶活。