肌球蛋白调节轻链去磷酸化调控宰后肌动球蛋白解离机理

Actomyosin dissociation contributes significantly to muscle aging and meat tenderness. Commonly, it is considered that actomyosin dissocation in muscle during postmortem was regulated by troponin，tropomyosin and calpain. However, we found that actomyosin dissociation was influenced by dephosphorylation of myosin regulatory light chain in postmortem muscle. The relationship of dephosphorylation and actomyosin dissociation will be identified in situ and vitro models based on postmortem muscle with significantly difference in dephosphorylation of myosin regulatory light chain. The myosin regulatory light chain dephosphorylation regulated by myosin light chain kinase and inhibitor ML-7 will be used to study the conformation sheet, neck lever shift and angle of myosin heavy chain. The cross-bridge number and hydrogen bonds in cross-bridge bonding domain will be determined in different dephosphorylation situ and vitro models. The conformation, ATPase activity and actomyosin dissociation energy in ATP binding domain will be investigated. The mechanism of actomyosin dissociation regulated by dephosphorylation of myosin regulatory light chain in postmortem muscle will be brought to lighter.

肌动球蛋白解离决定宰后肌肉的成熟进程和肉品嫩度，传统理论认为肌钙蛋白、原肌球蛋白和钙蛋白酶调控宰后肌动球蛋白解离，本项目组近期研究发现宰后肌球蛋白调节轻链去磷酸化影响肌动球蛋白解离，但具体调控机理并不明确。该项目拟以宰后肌球蛋白调节轻链去磷酸化水平差异显著肌肉为研究对象，通过肌细胞原位模型和纯化蛋白离体模型实验，确证宰后肌球蛋白调节轻链去磷酸化水平与肌动球蛋白解离的对应关系；用肌球蛋白轻链激酶和抑制剂ML-7体外调节肌球蛋白调节轻链去磷酸化水平，解析去磷酸化前后肌球蛋白重链头部的构象折叠和颈部杠杆位移、转角；采用原位模型和离体模型探明肌球蛋白调节轻链去磷酸化后肌球蛋白与肌动蛋白强结合横桥数量和氢键等作用力变化，分析肌球蛋白调节轻链去磷酸化修饰对肌球蛋白ATP结合域构象的作用，解析肌球蛋白ATPase活性和肌动球蛋白解离能量的变化，揭示宰后肌球蛋白调节轻链去磷酸化调控肌动球蛋白解离机理。

肌动球蛋白解离影响宰后肉的嫩度和保水性，在宰后肌肉中肌球蛋白调节轻链（MRLC）磷酸化影响肌动球蛋白解离，本项目揭示其机理。以肌球蛋白解离程度差异的肉样为实验材料，明确原位模型中MRLC磷酸化对肌球蛋白降解和肌动球蛋白解离的影响，验证离体模型中MRLC磷酸化与肌动球蛋白解离的关系，鉴定与肌动球蛋白解离密切相关的MRLC磷酸化肽段及位点，离体模型中调控肌球蛋白纯品中MRLC的磷酸化水平，研究MRLC特征位点磷酸化对肌动球蛋白解离的影响。研究结果为：.（1）MRLC磷酸化负向影响肌动球蛋白解离和MRLC、MHC降解。MRLC磷酸化水平与肌动球蛋白解离程度（r = -0.794，P < 0.05），MRLC降解程度（r = -0.764，P < 0.05）和MHC降解程度（r = -0.826，P < 0.05）均呈显著负相关。.（2）离体模型中MRLC磷酸化负向影响肌动球蛋白解离，与原位模型结果一致。MRLC磷酸化作用可能有助于肌球蛋白与肌动蛋白之间相互作用力形成，从而抑制肌动球蛋白解离。离体模型中MRLC磷酸化水平与肌动球蛋白解离程度呈显著负相关（r = -0.736，P < 0.05）。.（3）肌动球蛋白解离最密切相关的磷酸化位点为MRLC第15位丝氨酸。羊骨骼肌中MRLC第15位丝氨酸的磷酸化状态与肌动球蛋白解离呈显著负相关（r= -0.816，P < 0.05）。一些肌肉收缩蛋白、调节蛋白和结构蛋白，特别是MRLC、MHC、肌联蛋白和伴肌动蛋白的磷酸化也影响肌动球蛋白解离。.（4）MRLC第15（17）位丝氨酸磷酸化负向影响肌动球蛋白解离存在两条可能途径：一是MRLC第15位丝氨酸磷酸化通过增强肌球蛋白与肌动蛋白间的离子键、氢键、疏水相互作用形成而降低肌动球蛋白解离；二是MRLC第15位丝氨酸磷酸化引起肌动球蛋白动能和总能量降低，键能升高，从而降低肌动球蛋白解离。MRLC氨基酸序列匹配发现羊骨骼肌中第15位丝氨酸对应兔骨骼肌中第17位丝氨酸。