lncRNAs通过Wnt信号通路调控毛乳头细胞诱导毛囊再生的分子机制

Cashmere is the fine undercoat produced by the secondary follicle in the skin of cashmere goat, which shows cyclical growth. Dermal papilla cell controls hair follicle cyclical growth and involves in the interaction between Wnt signaling and stem cell niche. Wnt signaling also plays important roles in regulating hair follicle cyclical growth. LncRNAs can regulate cell proliferation, differentiation and migration via Wnt signaling pathway. Our previous study showed that there were three significant differentially expressed lncRNAs between hair follicle anagen and telogen. Bioinformatics analysis predicted that these three lncRNAs might regulate the key genes in Wnt signal pathway by cis- or trans-acting. However, how these lncRNAs regulate the dermal papilla cells in the secondary hair follicle to induce hair follicle regeneration is still unknown. In this study, the three identified lncRNAs will be targeted by CRISPR/Cas9-mediated dual surrogate reporter-integrated donor system in the dermal papilla cells, respectively, and the targeted cells will be used for hair xenotransplantation to explore the effects of lncRNAs on regulating dermal papilla cells to induce hair follicle regeneration. Subsequently, the potential target genes of the lncRNAs in the knocked out cells will be analyzed by RNA-seq. Combined with RNA immunoprecipitation, immunofluorescence and other technologies, the molecular mechanism of the lncRNAs during hair follicle growth will be revealed, which will provide reference for cashmere goat breeding practice.

羊绒是次级毛囊产生的纤细底层毛，呈周期性生长。毛乳头细胞能够调控毛囊周期性生长并参与Wnt信号/干细胞微环境间的互作，而Wnt信号在调控毛囊的周期性生长方面也具有重要作用。lncRNA能够通过Wnt信号通路调控多种细胞的增殖、分化和迁移。前期研究发现羊绒生长期和休止期差异表达的3个lncRNAs可能通过顺式或反式作用调控Wnt信号通路的关键基因，但lncRNA如何通过Wnt信号调控绒山羊次级毛囊毛乳头细胞诱导毛囊再生的机制未见报道。因此本研究利用CRISPR/Cas9双等位基因打靶系统在绒山羊次级毛囊毛乳头细胞中分别敲除3个lncRNAs后，通过异种移植诱导毛囊再生，利用免疫组化研究3个lncRNAs对次级毛囊毛乳头细胞诱导毛囊再生的影响；同时通过转录组测序筛选lncRNA潜在的靶基因。结合免疫共沉淀、免疫荧光等手段揭示lncRNA调控毛囊再生的分子机制，为绒山羊的育种实践提供理论指导。

本研究的目的是探讨lncRNA通过Wnt信号调控绒山羊毛乳头细胞诱导毛囊再生的机制，因此围绕绒山羊不同发生发育阶段差异表达的lncRNA H19、lnc852和lnc552对毛乳头（DP）细胞和毛囊干细胞（HFSCs）增殖分化的影响及其调控机制进行了研究，结果表明：过表达H19后能够促进DP细胞增殖，增强细胞活力，而且Wnt信号通路中关键基因β-catenin与lef1显著增高。进一步的研究发现H19通过chi-miR-214-3p/β-catenin激活Wnt信号通路，促进DP细胞增殖；Lnc852在毛囊分化阶段高表达，为了深入探究其功能，在HFSCs利用CRISPR/Cas9技术对其核心启动子进行了精确编辑；lnc552主要定位于HFSCs的细胞核中，过表达lnc552显著降低G2期的细胞比例，增加G1期的比例，从而抑制HFSCs的增殖。而且lnc552促进Bmp信号通路下游的SMAD1/5磷酸化，造成HFSCs的多能性下降，促进成脂分化。成纤维细胞生长因子FGF5和FGF21在生长期和休止期差异表达，主要在DP细胞中表达。过表达FGF5和FGF21后，Wnt信号通路的关键下游基因CTNNB1、TCF3和C-JUN在mRNA和蛋白水平都有不同程度的降低，增殖相关基因CCND1和C-MYC的表达水平下降，表明FGF5和FGF21通过抑制Wnt信号通路活性抑制DP细胞的增殖。由于miRNA能够充当lncRNA的分子海绵而发挥调控作用，因此对生长期和休止期的表达量存在显著差异的miR-30b-5p和miR-199a-5p的功能和调控机制也进行了研究，结果表明miR-30b-5p通过调控CAMK2D基因的表达而抑制DP细胞的增殖；miR-199a-5p能够调控VEGFA基因来抑制DP细胞的增殖。由于前期发现褪黑素处理HFSCs能够促进毛干生长，因此本研究对其调控机制进行了研究，发现褪黑素处理会显著增加Wnt信号通路下游基因C-JUN、C-MYC和CYCLIND1等的表达水平，并且提高多能性标记蛋白NANOG、OCT4以及CD34的蛋白表达水平。该项目系统研究了lncRNA和miRNA在毛乳头细胞和毛囊干细胞中的功能和调控机制，丰富了绒山羊毛囊发生及绒毛周期发育的分子机理，为绒山羊的分子育种工作提供理论支持。