小基因组菌株基因组的优化和繁殖速度的提高

Theoretically, genome-simplified strains or chassis are expected to grow fast and have robust metobolic characteristics. Contrary to these expectations, however, most previous studies failed to achieve these goals. Pseudomonas mendocina NK-01 can accumulate medium-chain-length polyhydroxyalkanoate (PHAMCL) inside the cell and excrete alginate oligosaccharide (AO) simultaneously, and thus is a promising producer for industrial use. The main contents of this project are as following: (1) Using a marker-less gene deletion method developed previously and information from bioinformation analysis of the whole-genome sequence, to conduct genome reduction in P. mendocina NK-01; deleting 15%-20% non-essential chromosomal regions while preserving those essential for cell growth and reproduction and for PHA and AO production; genome-simplified strains for production of PHA and AO will be constructed respectively, to further complete the construction of the Pseudomonas mendocina chassis; (2) Optimization of the genome-simplified strains by genome shuffling; (3) Study growth and production characterization of the genome-simplified strains; (4) Relocating oriC, and introducing multicopy oriC and genes encoding replication proteins (including dnaA) in NK-01 to improve cell growth rate.

从理论上讲，小基因组菌株或基盘细胞应该具有代谢旺盛和繁殖速度快的特征。但是，很多已报道的结果与人们的期望大相径庭。门多萨假单胞菌NK-01可在胞内积累中长链PHA，同时，向胞外分泌褐藻寡糖，是一株潜在的工业微生物菌株。本项目主要研究内容如下：（1）利用课题组已建立的门多萨假单胞菌无痕敲除操作系统；对已完成测序和生物信息学分析的门多萨假单胞菌NK-01进行基因组精简，在保证必需基因、复制原点及其侧翼基因、PHA和褐藻寡糖合成关联基因存在前提下，进行15-20%左右的基因组精简。完成可分别合成PHA与褐藻寡糖的小基因组菌株的构建，进一步完成基盘细胞的构建；（2）采用Genome Shuffling技术对小基因组菌株进行基因组优化；（3）对小基因组菌株进行生长特征和产物合成的研究；（4）开展复制起始位点移位以及oriC和包括dnaA基因在内的复制起始蛋白的多拷贝研究，以期加快菌体的繁殖速度。

门多萨假单胞菌NK-01是一株PHA合成菌，聚羟基链烷酸酯（PHA）可以由来自可再生资源的微生物生产，并且被认为是有前途的生物塑料以取代石油基塑料。项目组前期研究已经完成了该菌株的全基因组测序，本项目开展了该菌株的PHA代谢途径改造、复制起始蛋白多拷贝、及小基因组菌株构建的研究。本项目主要完成的研究内容包括：1） 利用已建立的门多萨假单胞菌NK-01无痕敲除的操作系统，对基因组精简了574KB，构建出删除10.56%冗余基因的优势小基因组菌株，并对所构建的一系列小基因组菌株进行了菌体性能及PHA发酵能力的测定；2）通过形态学工程、启动子工程、及代谢途径改造等多种手段，进一步优化了PHA合成菌株的发酵条件和产物产量；3）完成所构建的小基因组菌株生长特征与产物的合成研究；4）通过质粒多拷贝的方式，完成了门多萨假单胞菌NK-01复制起始蛋白基因多拷贝菌株的构建，优化了菌体的生长状态，提高了小基因组菌株和基盘细胞的繁殖速度；5）本项目执行期间，研究室共发表期刊论文17篇，申请中国发明专利1项，获得专利授权1项；培养研究生11人，其中硕士生4人，博士生7人。