解淀粉芽孢杆菌LL3小基因组菌株的构建及其聚谷氨酸合成研究

解淀粉芽孢杆菌LL3是一株谷氨酸非依赖型的γ聚谷氨酸(PGA)合成菌。项目组具有该菌株合成γ-聚谷氨酸的分子微生物学和发酵方面的工作基础。并且，完成了该菌株的全基因组测序，本项目拟开展该菌株的小基因组构建研究。主要内容如下：（1）利用生物信息学手段，分析获得必需基因、基因组岛和复制原点信息为基因组的精简奠定基础。（2）构建解淀粉芽孢杆菌无痕敲除的操作系统，包括两种方法：两步重组无痕删除基因法和拥有反向筛选标记MazF盒的两步无痕敲除法；（3）在保证必需基因、复制原点侧翼基因、γ-聚谷氨酸合成关联基因的前提下，对该菌进行10%左右的基因组精简敲除；（4）完成具有合成γ-聚谷氨酸功能的小基因组菌株的构建，对小基因组菌株进行生长特征和聚谷氨酸的合成研究。为我国工业微生物菌种改造探索出新的方法。（6）发表论文4-6篇，其中SCI收录论文3-4篇，申请中国发明专利1-2项。培养硕、博生6-8名。

Bacillus amyloliquefaciens LL3是一株谷氨酸非依赖型的γ-聚谷氨酸(Poly -γ-Gulutamic acid, PGA)合成菌。项目组前期研究已经完成了该菌株的全基因组测序，本项目开展了该菌株的小基因组菌株构建的研究。本项目主要完成的研究内容包括：①利用生物信息学手段，分别分析了该菌株的必需基因、基因组岛和复制原点，结果显示出：该菌株具有273个必须基因、拥有大片段可删除的基因组岛约25个、复制起始位点位于3994731-3994423包括：dnaA 1753-1973；②建立了利用温敏质粒结合反向筛选标记大片段无痕删除的操作方法；③在保证必需基因、复制原点侧翼基因和γ-聚谷氨酸合成关联基因的前提下开展了基因组的精简，目前已经完成了373KbDNA片段的无痕敲除，已敲除基因约占基因组的9.85%。④利用RNAseq对B. amyloliquefaciens LL3ΔpgsBCA菌株和B. amyloliquefaciens LL3野生型菌株进行了转录组测序分析，结果显示出：突变株LL3ΔpgsBCA较野生型LL3转录水平上调基因有164个，下调基因有67个，为基因组的进一步精简奠定了基础；⑤在精简基因组的同时，项目组构建了依次敲除pMC1、upp、epsA-O、sacB、glyc、lps、pta、ldh、cwlO、pgdS、luxS基因的PGA高产菌株，采用补料分批发酵γ-PGA产量达20.3g/L；⑥项目组还对B. amyloliquefaciensLL3细胞形态相关的有mreB、mreBH、mbl以及细胞分裂相关的有ftsZ、ftsA、sepF、parA和minD等骨架蛋白基因进行了研究，初步探讨了该菌株骨架蛋白与细胞分裂、细胞形态和合成产物之间的关系；⑦本项目在执行期间共发表论文17篇，其中SCI收录论文14篇，获得两项中国发明专利授权；培养硕士毕业生3名和博士毕业生5名。