ε-聚赖氨酸生产菌株的基因组重排与发酵优化机制

The secondary metabolites with antimicrobial activity are widely used in food and pharmaceutical industries. However their low levels in the wild type microbial producers can not meet the requirments of fermentation industry. The effective genetic modification and fermentative control based on the mechanism of metabolic regulation are necessary. ε-poly-L-lysine (ε-PL) as a microbial inhibitor with broad spectrum is recognized as a safe preservative and medical carrier, and has commercial values. In our previous study, the ε-PL producing strains with independent intellectual property were screened, and modified through genome shuffling. However the mechanism of high ε-PL productivity in the shuffled strain is unclear. This project aims at revealing the corresponding mechanism through the analyses of the relationship between the metabolite tolerance and shuffling orientation, changes of metabolic flux and enzyme activity at the key nodes in the metabolic pathway, and the control of the key enzymes activities by fermentation optimization. The expected results will not only be benefit for improving ε-PL productivity, but also provide a reference for modifying microbial inhibitor producing strains by genome shuffling.

具有抑菌作用的微生物次级代谢产物在食品、医药等领域应用广泛。然而，其在野生菌株中的产量低，不能满足发酵工业要求。基于代谢调控机理的有效遗传改造和发酵控制成为必须解决的关键问题。ε-聚赖氨酸（ε-PL）作为一种广谱抑菌剂，是公认的安全食品防腐剂和药物载体，具有重要的商业价值。申请人所在课题组采用基因组重排（genome shuffling）方法，对具有自主知识产权的ε-PL 生产菌进行新型遗传改造，获得了产量提高的菌株。然而重排菌株高产的机制尚不清楚。本项目将在此基础上，从ε-PL代谢途径关键节点物耐受与定向重排之间的关系，节点扰动对代谢流分配和酶活性的影响，以及发酵优化对关键酶合成与活性控制三个方面，阐明基因组重排造成ε-PL高产的机理。预期结果不仅有助于提高ε-PL 的发酵水平，而且对利用基因组重排改良抑菌剂生产菌株提供一定的理论指导。

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是由微生物合成的短肽，带有正电荷，是公认安全的食品防腐剂和药物载体，具有重要的商业价值。但是作为微生物的次级代谢产物，ε-PL发酵水平低，生产成本高。基因组重排（GS）作为一种递推式基因组重组技术，无需复杂的遗传工具和出发菌株的遗传背景，被认为是一种有效的工业微生物育种手段，但是与当今主流的分子育种相比，其定向性差，代谢调控变化的机制复杂。本课题以产ε-PL链霉菌的GS为出发点，结合关键节点物控制，增强重排的定向性，从代谢流通量配比和关键酶活性变化的角度，分析重排造成的代谢流变化，进而在发酵层面上加以佐证与控制。. 本研究取得的主要成果包括：1) ε-PL耐受型高产菌株的获得：一般认为与抗生素不同，抗菌肽抗性菌难以获得，但是本研究通过4轮GS，GS菌株的ε-PL耐受性大幅提升，而且正重排菌株所占比例随着重排轮数的增加而增加，摇瓶发酵最高产量达到3.11 g/L，是出发菌株的1.81倍。2) 代谢流分布导向ε-PL合成：将ε-PL耐受型菌株与具有底物和中间节点物耐受型的菌株，进行种间GS，获得ε-PL高产菌株，代谢通量分析 (MFA) 表明，重排后代谢流导向前体L-赖氨酸和ε-PL，酶活性分析显示天冬氨酸激酶活性显著增强，与MFA结果相一致。另外，种间重排导致了磷酸戊糖途径和三羧酸循环通量配比的改变，通过外源添加葡萄糖酸钙，证实这种变化有利于ε-PL的合成。3) 氧化胁迫效应：首次发现在ε-PL发酵过程中链霉菌胞内活性氧类水平上升，导致发酵后期菌体活力下降。GS菌株的抗氧化胁迫能力显著高于出发菌株，从而有效地减弱了氧化损伤，维持了发酵后期菌体活性。4)发酵过程优化控制：基于上述GS菌株的生理与生化特征，在外源物质流加，pH及溶氧控制，培养基优化等方面进行发酵工艺控制，5L罐补料-分批发酵168 h，ε-PL产量大于40 g/L。. 以上研究成果不仅提高了ε-PL发酵水平，而且为利用GS改良抑菌剂生产菌株提供了一定的理论依据。