以蓝藻PDHc E1为靶标的新型杀藻剂的合理设计与化学生物学研究

At present, there are no reports about algicide with pyruvate decarboxylase (PDHc-E1). In view of the serious problems of cyanobacterial bloom and the pollution of non-selective chemical algicide for the water environment. PDHc-E1 in cyanobacteria is chosen as a target of algicide in this project. Based on the three-dimensional structure of cyanobacteria (Cy) and human (or pig )PDHc-E1 respectively and catalytic decarboxylation mechanism, a new idea for the design and synthesis of high selective cy PDHcE1 inhibitors is proposed according to the differences of combined models between the coenzyme TPP and Cy-PDHc-E1 or pig PDHc-E1.. In this study, cyanobacteria PDHc-E1 gene is first cloned and expressed, the new method for enzyme inhibition assays in vitro will be set up. Meanwhile, the virtual screening or predicting model are established by using molecular simulation technology to guide molecular design and synthesis. Binding modes of the protein-inhibitor interaction will be studied by molecular docking and site-specific mutagenesis to comfirm the acting site of the active site of Cy PDHc-E1. The enzyme-inhibitory activity, algicdal activity of compounds, and the relationship of structure-activity will be studied. The mechanism of killing algae and application performance of high active compounds as algicide are examined. . It is expected that some effective Cy PDHc-E1 inhibitors with good selectivity between mammals and blue algae PDHc-E1 can be found by this project, and these active compounds can be used as new lead compound or potential algicide. This project will provide the basis of experiment and theory for the biorational design of novel Cy PDHc-E1 inhibitor.

目前国内外未见有以丙酮酸脱羧酶 (PDHc-E1)为靶标的杀藻剂的报导, 针对目前蓝藻水华严重，现有非选择性化学除藻剂对水环境带来汚染的现实问题, 本项目选择蓝藻PDHc-E1为杀藻剂靶标，基于对蓝藻和人体(或猪)PDHc-E1的三维结构、催化脱羧反应机制的认知, 提出了针对辅酶TPP与蓝藻或温血动物PDHc-E1结合模式的差异性来设计合成高选择性PDHc-E1抑制剂类杀藻剂的新思路。本项目将首次对蓝藻PDHc-E1基因克隆表达，构建其酶抑制活性的体外筛选新方法。同时采用计算机分子模拟技术模建理论筛选或预测体系指导分子设计与合成。采用分子对接理论研究和定点突变实验相结合的方法探明PDHc-E1与抑制剂相互作用模式和关键作用位点。研究酶抑制活性与杀藻活性及构效关系。评价高选择性、高效抑制剂作为杀藻剂的作用机制和应用的性能, 以及化合物对藻毒素生成的影响和安全性, 发现新型杀藻剂或先导体。

面临我国保护水环境，治理蓝藻水华的重大需求, 针对现有杀藻剂选择性差，常用含铜杀藻剂中的重金属铜离子对水体环境危害大的问题，本项目提出了以蓝藻PDHc-E1为靶标，设计合成针对蓝藻PDHc-E1靶酶的抑制剂来获得高效与高选择性杀藻剂的新思路。本项目首次通过异源表达成功获得了纯度高于90%的蓝藻PDHc E1。利用分子模拟技术首次对蓝藻PDHc-E1进行了三维结构模建，构建了理论筛选模型。针对辅酶TPP在蓝藻和猪PDHc-E1酶的活性空腔相互作用的差异，通过优化先导体结构，设计了4大类新型取代嘧啶衍生物的新骨架, 建立了7个系列新型目标化合物的合成方法。采用计算机分子模拟技术的预测体系指导分子设计, 合成了99个未见文献报道的新型目标化合物,完成了结构表征。.通过分子设计合成，构效关系，结构优化，活性验证研究的多次循环，发现了II，III和IV系列中多个化合物对蓝藻PDHc E1具有显著抑制活性，优于某些商品化杀藻剂的防效。并且还显示了对猪PDHc E1弱抑制作用和对班马鱼低毒的特点。本项目采用分子对接、定点突变、酶学分析和荧光光谱分析相结合的方法，探明了合成抑制剂在蓝藻PDHc E1和猪PDHc-E1活性空腔中的结合模式的差异。并进一步采用定点突变技术验证了抑制剂与靶酶的关键作用位点。从作用方式上解释了抑制剂的选择性机理，证明了设计思想的合理性和高效性。在研究中，意外发现高杀藻活性的Ic系列具有靶向蓝藻光合作用系统的杀藻作用机制。因而， Ic，II，III和IV系列可作为杀藻剂的新型先导结构。此外，本项目还获得了数个比商品化杀菌剂克菌丹（作为PDHc抑制剂），戊唑醇，叶枯唑或噻菌铜防效更优的高活性化合物。达到了预期的研究目标。.本项目获得了高杀藻活性的目标化合物克服了现有杀藻剂选择性差，对斑马鱼毒性较高，对水体重金属离子汚染（如硫酸酮copper sulfate等）的问题。对于创制高效、高选择性、低毒、环境友好的新靶标杀藻剂具有重要的科学意义和应用价值。