RRV诱导新生鼠肝内Th1炎症通路激活并致胆道闭锁的调控机制研究

胆道闭锁（BA）发病机制不明，存在诸多争论。近年来国内外多位学者使用轮状病毒（RRV）感染新生Balb/c型小鼠成功复制BA模型，验证了特殊嗜肝性病毒在特定窗口期感染可引发破坏胆管上皮的炎症病变而诱导BA发生的理论。然而有关该炎症反应类型，产生诱因和损伤胆管上皮的详细机制并不清楚。申报者在前期工作基础上推测，病毒感染损伤胆管上皮后所暴露出的特异性自身抗原激活了Th1亚型炎症细胞，并在其它免疫细胞及调控因子联合作用下产生特异性损伤胆管上皮的Th1炎症病变。本课题将在前期研究基础上建立新生鼠BA模型，首先应用流式细胞术找出介导BA鼠肝内外炎症反应的细胞亚型和关键调控因子，其后观察能否通过封闭相应免疫细胞活性或阻断相关因子表达而逆转胆管上皮破坏，最后应用ELISPOT技术找出诱发BA鼠肝内外炎症反应激活的外界因素。这不仅丰富了病毒感染引发BA的理论学说，同时为BA免疫调节治疗提供了有力实验依据。

随着对胆道闭锁（Biliary atresia, BA）病因学研究深入，越来越多的学者认同大多数BA肝内外胆管闭塞是由于围生期遭到病毒感染后引发了某种特殊炎症反应所致。然而有关BA肝内炎症反应类型并不明确，其调控机制和具体作用过程仍在研究之中。本实验探讨了腹腔感染轮状病毒（Rotavirus,RRV）诱导新生Balb/c小鼠发生胆道闭锁这一病理过程中，新生鼠肝内起主要调控作用的免疫细胞亚型及炎症因子，同时结合临床研究并通过初步的药物干预实验为BA的免疫调节治疗提供了理论依据。首先我们使用MMU18006型RRV感染MA-104细胞进行病毒扩增，获得足够浓度病毒后通过腹腔注射的方法感染SPF级新生Balb/c小鼠并成功诱导其发生胆道闭锁。然后采用流式细胞术对感染后不同时期新生鼠肝脾组织内炎症细胞亚型进行测定分析；使用PCR-ARRAY的方法筛查BA鼠肝内表达明显改变的调控基因；使用免疫组织化学的方法对新生鼠和临床胆道闭锁患儿肝内iNOS、MCP-1、MIP-2的表达进行检测；同时对临床胆道闭锁患儿术后胆管炎相关危险因素进行随访分析；最后使用免疫抑制剂FK506及普伐他汀进行药物干预并检测炎症细胞亚型的表达改变。实验结果示：1）轮状病毒感染新生鼠7d时胆管出现狭窄，14d时能够观察到闭锁；2）CD8+Tc细胞及Treg细胞可能起主要调控作用，但CD4+Th细胞、CD8+Tc细胞、NK细胞、巨噬细胞及Treg细胞广泛激活并共同参与了这一特异性炎症反应；3）PCR-ARRAY基因筛查发现BA鼠肝内与T细胞、巨噬细胞及NK细胞激活相关的调控基因表达明显上调；4）iNOS、MCP-1、MIP-2的表达升高可能在BA新生鼠及胆道闭锁患儿肝内胆管损伤及肝纤维化过程中起重要作用；5）临床随访发现胆道闭锁患儿Kasai术后胆汁引流通畅，辅以激素治疗，术中预留胆攀长度充分的BA患儿，术后胆管炎发生率低。6）FK506可明显抑制CD4+Th细胞、NK细胞及巨噬细胞激活，普伐他汀可抑制CD4+Th细胞、NK细胞激活，两者对CD8+Tc细胞及Treg细胞无调控作用。使用普伐他汀可减少RRV感染后的闭锁率及新生鼠注射后的死亡率。通过该项目所取得的结果较好解释了RRV感染新生鼠造成胆管损伤、闭塞的具体上下游调控机制，同时为BA的免疫调节治疗提供了理论和实验依据