ULK信号在中波紫外线抑制人角质形成细胞自噬中的作用机制研究

In our previous study, we found that keratinocytic autophagy can be prohibited by UVB radiation. Thus, the substrates of autophagic process will be determined to identify whether the autophagic activity is inhibited. Some inducers of autophagy will be screened and used to analyze whether inhibition of autophagy can be retrieved. Western-blot, co-IP and fluorescence colocalization will be used to confirm whether ULK1 signaling is inhibited by UVB. The drugs regulated mTOR activities will be use to identify whether ULK1 signaling and autophagy were inhibited in mTOR independent mechanism. ULK1 protein will be up-regulated by over-expression of exogenous gene, and ULK1 signaling will be activated by pharmaceutical inducer in this research. Then, these methods regulated ULK1 signaling will be used to identify whether inhibition of autophagy can be retrieved. The drugs regulated MAPK and AMPK pathways and RNAi will be used to identify whether ULK1 signaling and autophagy is regulated by these pathways. The role of ULK1 signaling in inhibited autophagy of keratinocyte exposed to UVB will be demonstrated in this research. This work is essential to clarification of molecular mechanism about inhibition of keratinocytic autophagy after UVB radiation.

基于前期已证实UVB抑制角质形成细胞自噬流基础上，分析自噬底物，阐明自噬活性是否受到抑制；筛选数种可能的自噬诱导剂，并分析它们是否可以恢复被UVB抑制的自噬；采用蛋白免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光共定位的方法分析UVB照射细胞中的前期初步证实的抑制的ULK1信号，明确ULK1信号的调控状态；利用mTOR的工具药物，分析ULK1信号和自噬抑制是否以非mTOR依赖性方式调控；利用外源基因过表达上调ULK1蛋白表达，以及药物孵育激活ULK1信号，分析是否可恢复被UVB抑制的自噬流和自噬活性；进而，利用信号通路工具药和RNA干扰的调控方法，分析UVB照射的角质形成细胞中ULK1信号是否受AMPK和MAPK通路的调控，以及这两条通路是否参与了UVB对角质形成细胞的自噬抑制。通过本课题可初步阐明ULK1信号在UVB对角质形成细胞自噬抑制中的作用。为阐明UVB调控角质形成细胞自噬的分子机制研究奠定基础。

在本课题的支持下，我们明确了UVB对角质形成细胞自噬活性具有显著的阻滞效应；自噬抑制效应与凋亡活性没有直接的关联，原因可能与细胞焦亡参与了UVB触发的细胞死亡有关；我们阐明了UVB对角质形成细胞ULK1信号的抑制效应与自噬调控机制的密切关系；阐明了UVB调控ULK1信号的机制与转录水平的抑制密切相关；阐明了UVB对ULK1信号和自噬的调控以非mTOR依赖的方式进行，并且角质形成细胞中的不同MTOR信号抑制方式在诱导自噬效应中具有显著差异性，MTOR通路在UVB触发的系列细胞反应中未证实起到核心作用；发现了ULK1在人皮肤紫外线暴露中存在转录抑制的情况，具备了成为紫外线皮肤损伤的标志物的潜在应用价值；棉子糖处理通过非mTOR依赖的自噬诱导产生了对UVB诱导人角质形成细胞光损伤的保护作用；芹菜素处理抑制原代人表皮角质形成细胞中UVB诱导的细胞凋亡和细胞死亡，自噬相关基因ATG5 RNA干扰所导致的自噬抑制阻止了芹菜素诱导的ATR，ATM和BiP的恢复，这些蛋白在暴露于UVB辐射的原代人表皮角质形成细胞中被下调；进行了番茄红素对原代角质形成细胞和鳞状细胞癌细胞系自噬调控研究，并发现其通过MTOR通路调控细胞黏附分子，影响肿瘤细胞的生物学功能；salirasib处理导致人原代角质形成细胞c-Raf，ERK和Akt信号的失调，MTOR信号的阻断，Beclin 1相关自噬调节的中断，细胞凋亡的激活和部分细胞周期调节蛋白的下调，但在人皮肤鳞状细胞癌细胞系COLO-16中没有表现出类似的作用。通过本课题的支持我们初步阐明了ULK1信号在UVB对角质形成细胞自噬抑制中的关键作用，为阐明UVB调控角质形成细胞自噬的分子机制研究奠定基础，为紫外线皮肤损伤的发病机制和干预研究工作提供了理论依据。