无机类氰化物生物降解途径及代谢调控研究

自然界中存在大量可利用和代谢无机类氰化物的生物资源，是研究和开发生物法治理氰污染技术的基础。本项目在前期研究基础上，进一步筛选获得可降解不同形式无机氰化物、适应不同环境条件的微生物，丰富已有的降氰菌种库，并从活性菌株中克隆出降解酶的功能基因；选择2-3株有代表性的微生物研究无机类氰化物的生物降解和代谢过程，通过监测和比较中间产物和终产物的组成和含量变化、底物消耗、细胞生长、酶活水平变化等参数，分析和判断出氰的降解途径和微生物关键酶，并进一步比较和分析各种环境因子和极端条件对微生物的氰降解途径和产酶水平、种类的影响，最终归纳出代谢调控机制。研究成果不仅可为氰污染生物治理提供一些有自主知识产权和实用价值的微生物及基因资源，也能成为剧毒性污染物生物处理过程优化和调控的科学依据。

项目围绕氰的生物降解机制研究，以碱性、贫氧等环境为选择压力，构建出适应不同底物体系的微生物菌株库，其中菌株DN12可在pH10、贫氧环境下以含氰化合物为唯一氮源生长；菌株DN25的氰耐受能力和降氰活性达到文献报道高水平。重点研究DN25（经鉴定为产碱杆菌属）对氰的代谢规律。DN25不仅能利用氰化钾为唯一氮源生长，还能利用乙腈、硫氰酸钾和亚铁氰化钾等含氰化合物。菌体生长和对氰降解速率与pH、初始氰浓度及接种量等有关。在pH 7-9范围内降解效果良好，可耐受浓度高达43 mM的氰化钾，在接种量5%、氰浓度25 mM时，初始降解速率达到最大值14.58 mM·h-1。菌体还可进一步利用代谢产物生长。成功从DN25中克隆出降氰酶基因cdE并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了氰水解酶的活性表达，测序结果表明此降氰酶基因由一个长度为1004 bp的开放读码框组成，蛋白由334个氨基酸构成，融合蛋白分子量38 kDa左右。优化诱导表达条件，在28℃、0.3 mM IPTG时，诱导表达12 h后OD600达到最大。使用镍柱亲和层析一步纯化获得的重组酶纯度达到95%以上。此重组氰降解酶与源自Pseudornonas stutzeri AK61的氰水解酶的序列同源性高达99.8%，但降解产物不同，重组降氰酶的降解产物包括甲酸、甲酰胺和铵，其中甲酸和甲酰胺的生成速率为4：1，而且甲酸生成与甲酰胺的二次水解无关；并证明氰的降解作用仅来源于酶。根此认为此降氰酶与AK61氰水解酶存在功能上的差异，即同时具有水解酶和水合酶活力且两个反应同时发生。此种能催化无机氰化物同时生成甲酸又生成甲酰胺的酶尚未见文献报道。.在传统填充床反应器的基础上结合生物过滤器构建4.5L复合式固定化细胞反应器，对于高浓度氰化物有良好降解效果。当进口氰浓度高达450 mg/L和650 mg/L时水力停留时间为24 h时去除率即可达到98%以上，且排出气体中未检出氰化物。复合反应器可连续运行45天，去除率基本维持在95%至98%，而且可耐一定的负荷冲击。