纤维素酶系列增效蛋白的理性搜寻及其协同过程动力学研究

The compact of the cellulose structure and the characteristics of crystallization are bottlenecks to the cellulose enzyme hydrolysis. Basedd on the previous work, the object of this project is to find for different kinds of novel cellulase-activity-enhancing proteins in cellulase-producing microorganism, which is proposed according to the hypothesis of natural evolution. The novel enhancing protein isolated from the typical cellulase-producing microorganism will be identified and cloned to construct the gene and protein database. Among the obtained typical novel cellulase-activity-enhancing proteins, 2-3 proteins will be studied as a model to clarify the synergetic mechanism between enhancing protein and cellulase by investigating the cellulose hydrolysis process. Through determining the medium and end products changes and the microstructure and morphological changes of substrates, the synergetic kinetic models will be constructed including absorption and mass transformation and the kinetic parameters calculated, so as to qualitatively and quantitatively evaluate the synergetic degree of different kinds of cellulase-activity-enhancing proteins.The expected research findings of this project may not only provide microorganism and gene resources with self intellectual property rights and practical value for construction of cellulose degrading gene engineering microorganism, but also provide the scientific basis for the optimization and regulation of the cellulose hydrolysis process.

纤维素的致密结构和结晶化特性是制约纤维素酶水解的瓶颈问题。本项目在前期研究工作的基础上，根据自然进化机制，提出从产纤维素酶的系列微生物发酵液中系统寻找和分离具有协同纤维素酶水解作用的非酶蛋白，以期获得更多种类的新型纤维素酶增效蛋白。将选择有代表性的产纤维素酶的微生物进行发酵培养，提取、分离、纯化、鉴定获得目的非酶蛋白，并克隆其基因，建立非酶增效蛋白数据库。选择2-3种有代表性的新型增效蛋白研究其与纤维素酶协同水解过程，阐明其增效作用机理；通过检测降解过程中间物、产物变化及纤维原料的形态、结构及组成变化，分析不同外部条件对增效作用的影响，构建包括吸附、传质等作用的协同过程动力学模型，求取动力学参数，从而达到定性定量评估不同增效蛋白的增强作用。研究成果不仅可为构建纤维素水解基因工程菌提供有自主知识产权和实用价值的微生物及基因资源，也能成为纤维素水解过程优化和控制的科学依据。

建立筛选模型从土壤中分离得到8株产纤维素酶增效蛋白的菌株，其中Pseudomonas oryzihabitans、Streptomyces M2和Frankia sp三株菌株所产的增效蛋白对纤维素酶酶活增效尤其显著。利用生物信息法搜寻到10个潜在的产纤维素酶增效蛋白菌株，其中成功从Streptomyces ipomoeae菌中克隆出纤维素酶增效蛋白基因，并构建了一株产纤维素酶增效蛋白工程菌Rosetta（DE3)/pET32a，经测定，纯化的表达蛋白增效活性为96%。由来建立了产非酶增效蛋白菌种数据库。.通过超滤、硫酸铵盐析、Octyl-Sepharose CL-4B疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤等步骤从相关菌株中开展了构成纤维素酶系中各成分酶的分离纯化和纤维素酶增效蛋白的分离纯化。从含纤维素酶丰富的康氏木霉GIMP3.444菌株中分离纯化出了两种内切β-葡聚糖苷酶，部分纯化出了一种外切β-葡聚糖苷酶及一种β-葡萄糖苷酶；从菌株POEP1胞外培养物中分离纯化到一种无纤维素酶活的增效蛋白POEP1，SDS-PAGE测定其分子量约为60kDa。经MALDI-TOF/TOF质谱分析，POEP1可能是一种蛋白序列与扩张蛋白及类扩张蛋白不同的新型纤维素酶增效因子。从Streptomyces M2胞外培养物中分离纯化到2种具纤维素酶增效作用的粗蛋白，增效活性分别为80%、127%。.增效蛋白POEP1与纤维素酶协同作用分析表明，增效作用与纤维素酶用量有很大关系，在低纤维素酶加载量的反应中POEP1更易表现出高的增效效果。如在POEP1的用量为700 μg/g滤纸、用酶量为0.1 U/g滤纸时，协同增效活性达364%。通过红外光谱（FTIR）、X射线衍射仪（XRD）、扫描电镜（SEM）等仪器测试增效蛋白处理前后的纤维原料的形态、结构及组成变化来阐明增效作用机制。POEP1增效作用机理与expansin 和 expansin-like蛋白类似\。.对纤维素酶在滤纸、甘蔗渣、稻草、机械活化处理蔗渣等不同纤维原料上吸附过程分析表明，吸附行为均可用Langmuir方程来描述，只是不同纤维原料上的吸附饱和浓度、吸附平衡常数各不相同。此外，纤维素酶在纤维原料的吸附不仅与纤维原料的种类（组成）有关，还与纤维原料的可及性有关。