α-蒎烯的生物降解机理及代谢流调控

α-蒎烯是一类环境排放速率最大、积累浓度最高的单萜烯类VOCs，它在环境中的迁移和转化严重威胁人类健康与生态安全。.本申请针对目前α-蒎烯微生物降解的机理尚不明确、产物存在二次污染等问题，提出通过定向调控α-蒎烯的微生物代谢流以实现α-蒎烯废气净化与资源化。本研究将对本土降解菌Pseudomonas veronii ZW 代谢α-蒎烯的产物进行定性定量测定，建立细胞内外的有机碳代谢流，并对菌株代谢过程进行数学描述和碳元素平衡分析，在此基础上建立α-蒎烯的微生物代谢流；鉴定代谢过程中关键蛋白酶种类并测定氨基酸序列，利用基因敲除等分子生物学技术构建基因工程菌，对菌株代谢流进行定向调控，使α-蒎烯代谢流停留在关键产物2-甲基丁酸步骤，同时通过环境优化、代谢强化等方法促使菌株积累2-甲基丁酸的能力进一步增强，为α-蒎烯废气的生物净化与资源化工程应用奠定基础。

针对目前α-蒎烯微生物降解的机理尚不明确、产物存在二次污染等问题，本项目通过定向调控α-蒎烯的微生物代谢流以实现α-蒎烯废气净化与资源化。.Pseudomonas veronii ZW降解α-蒎烯的过程符合Haldane动力学模型，最大比生长速率为0.10253h-1、最大比降解速率为0.33586 h-1。通过GC-MS检测到菌株ZW降解α-蒎烯产生的中间产物，结合相关文献，推测出菌株ZW降解α-蒎烯的三条可能代谢途径：①α-蒎烯转化为桃金娘烯醇，桃金娘烯醇再进一步转化为桃金娘烯酸；②α-蒎烯转化为柠檬烯；③α-蒎烯转化为伞花烃，伞花烃转化为4-异丙基苯甲醇和3-羟基-4-异丙基甲苯。.利用紫外诱变获得一株丧失α-蒎烯降解能力的菌株ZW-U，其形态和抗生素敏感性与正常菌株ZW基本保持一致。诱变菌株ZW-U对α-蒎烯、伞花烃、4-异丙基苯甲醇和2-甲基-1,4丁二醇的降解能力明显下降甚至丧失了降解能力，这可能与紫外诱变使得菌株ZW-U缺失了α-蒎烯、伞花烃、4-异丙基苯甲醇和2-甲基-1,4丁二醇的降解酶或者抑制了这些酶的合成。.利用双向电泳及生物质谱技术分离并鉴定了16个特异性差异蛋白质。根据蛋白质的功能，将这些差异性蛋白分为氨基酸合成、能量转化、蛋白折叠、解毒或保护蛋白、调节蛋白、与α-蒎烯代谢相关蛋白等6大类。其中与α-蒎烯代谢有关的酶是PKHD型羟化酶和芳基醇脱氢酶。PKHD型羟化酶作用于伞花烃转化为3-羟基-4-异丙基甲苯；芳基醇脱氢酶作用于4-异丙基苯甲醇转化为4-异丙基苯甲醛。.选定枯茗酸为目标代谢累积产物。通过pSC123 转座子诱变和影印平板法构建了枯茗酸降解失活的突变株文库，筛选获得大量突变株，选择 了3株作为目的突变株，它们既能降解α-蒎烯，又能累积枯茗酸。编号为ZW-A的突变株在降解100mg/L的α-蒎烯过程中，枯茗酸的累积量达到16mg/L。利用SEFA-PCR 的方法扩增得到683 bp 的片段，其中的orfA被插入突变。orfA与 Pseudomonas 的protein RadC的同源性达到96%以上。