Src的结构域SH3调控细胞骨架蛋白功能在肺腺癌侵袭转移中的分子机制研究

细胞骨架重组后的细胞变形迁移是肿瘤侵袭转移的重要机制之一。我们前期研究发现：较早远处转移的肺腺癌细胞Src特征性高表达活性，但具体意义不明。Src蛋白与肿瘤转移密切相关，其主要功能片段激酶区可通过与底物的级联放大作用，激活整合素等信号通路间接介导细胞骨架改变导致细胞变形迁移。但最近发现Src的SH3域，体外可直接结合其他非激酶途径的、能与细胞骨架作用的中间信号蛋白。因此我们认为：肺腺癌特征性Src高活性表达，其SH3域介导细胞骨架改变，激活FAK等信号通路参与了肺腺癌的侵袭转移。本研究拟构建Src的SH3域、激酶区突变下调载体，分别转染高表达和低表达Src的A549、NCI-H23细胞株，采用免疫荧光、免疫印迹、激光共聚焦显微镜等方法观察对细胞骨架的影响，以及裸鼠接种成瘤的影响；并检测可能相关的信号通路。明确Src的SH3域对细胞骨架蛋白的作用，并从相关的信号通路阐明其分子机制。

研究背景：非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型。在过去的20年内，非小细胞肺癌的5年生存率仍然低于15%。目前缺乏特异并且精确的分子标记物来预言非小细胞肺癌患者的生存率，因此，寻找这类分子标记物显得具有重要意义。ARHGEF5 和Src蛋白具有致瘤性，但是两个蛋白在非小细胞肺癌中的作用不明。.研究目的：评估ARHGEF5 (即Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子5)在非小细胞肺癌中，特别是肺腺癌细胞中的作用。.实验设计：免疫组织化学检测外科切除的非小细胞肺癌患者的病变组织中ARHGEF5和src的表达，统计分析其相关性。Western Blot进一步验证肺癌细胞系中的蛋白表达情况。ARHGEF5和src的物理性结合状态采用细胞免疫荧光检测和免疫共沉淀法。上调或下调ARHGEF5表达后，流式细胞检测细胞周期和增殖情况，细胞划痕实验初步检测细胞迁移情况。最后，动物体内试验验证。.实验结果：193例患者中，男性145例，女性48例。年龄从31岁到84岁，平均61.84岁。其中99例肺鳞癌（占51.30%），94例肺腺癌（占48.70%）。133例阳性表达ARHGEF5蛋白（阳性率68.91%），主要表达于胞浆。ARHGEF5阳性表达相关于患者的年龄、分化、肿瘤分期（p<0.05）。并且在全部非小细胞肺癌病例和其中的肺腺癌病例中，均发现ARHGEF5和src表达显著相关（χ2=11.874, P<0.01; χ2=12.194, P<0.01），而肺鳞癌患者中，两个蛋白的表达无关联。免疫共沉淀和细胞免疫荧光检测进一步证实了ARHGEF5和src物理性的相互作用。在对ARHGEF5阳性表达对患者生存期的研究中发现，ARHGEF5(+)/Src(+)组的生存期明显低于其他三组患者的生存期（ARHGEF5(+)/Src(—)，ARHGEF5(—)/Src(+)，ARHGEF5(—)/Src(—)三组），其平均生存时间为29.37月/39.90月，p值为0.029。Western Blot检测非小细胞肺癌细胞株中ARHGEF5蛋白的表达量，均发现高表达。下调ARHGEF5后，细胞的迁移能力降低，细胞周期和细胞凋亡改变。动物体内试验需要进一步验证。.实验初步结论：ARHGEF5蛋白作为原癌基因，在人非小细胞肺癌的生长、转移中发挥了重要作用。