米曲霉人工染色体异源表达滇重楼内生杂色曲霉大片段沉默基因簇定向挖掘新天然产物探究

Heterologous expression is one of the best way to activate of the silent Natural Product Biosynthesis Gene Cluster (NPBGC) for guiding isolation of novel natural products from the filamentous fungi. However, it is very difficult to use this method to express large fragment NPBGC (>50 kb) for the limited heterologous host and vector. The pre-experimental results showed that the Fungal Artificial Chromosomes (FAC) could be successfully shuttled between Escherichia coli and the heterologous expression host Aspergillus oryzae. This is the first time to construct a FAC based on heterologous expression host Aspergillus oryzae in the world. Therefore, we hypothesized that the FAC constructed by us might be used to heterologous express of the large fragment NPBGC originated from filamentous fungi. In order to verify this hypothesis, we firstly intend to construct a gDNA library for one strain of endophytic Aspergillus versicolor isolated from Paris polyphylla var. yunnanensis. Secondly, we will use bioinformatics method to analyze the genome sequence of the Aspergillus versicolor and then filtering the gDNA library and finding the cryptic NPBGC. Lastly, we will use PEG guided protoplast transformation method to transform the selected NPBGC into the heterologous expression host Aspergillus oryzae to find the novel natural product. This project will firstly use FAC constructed based on the Aspergillus oryzae heterologous expression host to activate of the large fragment silent NPBGC originated from endophytic fungi isolated from medicinal plant to find novel natural product. In addition, we also hope that this project could provide new ideas for guiding discovering novel bioactive natural product from natural source.

利用异源表达激活丝状真菌中的沉默天然产物生物合成基因/基因簇，是一条行之有效地定向发现新天然产物的途径。然而，受异源宿主和表达载体的局限性，使得该方法的应用，尤其在表达大片段（>50 kb）基因簇时遇到了很大的困难。我们预实验首次针对米曲霉构建的丝状真菌人工染色体可以在大肠杆菌和米曲霉中自由穿梭。为此我们提出假说：米曲霉丝状真菌人工染色体系统或可解决真菌大片段沉默基因簇异源表达的难题。为了验证这一假说，我们将利用构建好的人工染色体系统针对一株来源于药用植物滇重楼的内生杂色曲霉构建基因组文库，结合生物信息学分析杂曲霉基因组，并对文库进行筛选，定位潜在的沉默基因簇，最后将携带基因簇的质粒转化到米曲霉中进行异源表达，挖掘全新的天然产物。本研究将从米曲霉人工染色体异源表达药用植物内生真菌大片段基因簇，挖掘新天然产物这个新视点为激活丝状真菌沉默基因簇，定向发现新活性天然产物提供一定的思路。

异源表达是发现天然产物、解析天然产物生物合成途径、鉴定重要酶的功能和阐明其催化机理的重要手段。米曲霉宿主已经被证明是一个非常高效率和安全性的异源表达体系，可以实现多基因的高效率表达。现有米曲霉的表达体系对于40kb以下的大片段基因簇都可以成功实现，然而，天然产物的生物合成基因簇，尤其是真菌来源天然产物生物合成基因簇往往大于40kb，继而导致大量大片段基因簇难以通过异源表达手段进行研究。为了解决上述问题，本项目在原有方案下，依托米曲霉（Aspergillus oryzae NSAR1）真菌体系成功构建了一套人工染色体异源表达体系，可以快速实现50kb以上基因簇的异源表达。我们完成内生杂色曲霉（A. versicolor）全基因组测序、组装、注释以及转录组测序和组装工作，并完成了其gDNA大片段文库的构建工作，平均插入片段125kb，获得克隆4608个，覆盖率10X，经过随机抽检，基因片段未插入率为1/9。利用生物信息学分析所测序基因组，结合BAC文库的筛选，获得天然产物生物合成基因簇180条，其中直接与天然产物骨架相关（聚酮化合物、非核糖肽类、萜类）基因簇超过100条。. 依靠前期建立的米曲霉（Aspergillus oryzae NSAR1）真菌人工染色体异源表达体系对筛选得到的22 条基因簇进行了异源表达，成功的激活了15 条基因簇（另有7 条基因簇的异源表达并未发现产物），从15 条基因簇中分离得到化合物39 个，其中新化合物14 个（*为新化合物）。对其中部分化合物进行了抗菌、细胞毒活性测定发现6个化合物具有较好的生物活性，值得进一步深入研究。证实了原有设想，为大片段基因异源表达挖掘活性天然产物提供了借鉴。.此外，作为与本项目密切相关的拓展性研究，我们利用米曲霉异源表达体系实现了内生青霉来源化合物gregatin的生物合成途径解析，同时利用转录调控因子激活，表观遗传学手段策略研究了其它几株内生真菌以及民族药的化学成分，发现了多个活性天然产物。. 依托本项目共发表研究论文8篇，其中SCI论文7篇，其中IF>15论文一篇，IF>5论文1篇，申请专利2项。