海洋曲霉属真菌次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达研究

Marine fungal secondary metabolites (SMs) are a rich source of useful compounds. But it is difficult to obtain marine fungal SMs under laboratory condition due to their special habitat. The majority of SM clusters are silent or low-expression under most conditions. The biosynthetic research to identify gene function and intermediates is considered to be an important approach to develop marine fungal natural products. Most marine fungi, however, have poor or nonexistent molecular genetic systems. We have got the genome sequence of a marine Aspergillus sp. strain, which allowed us to predicted ten non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) gene clusters by gene mining. Based on these information, we will construct expression cassette of the ten NRPS gene clusters by yeast recombination method, placing genes under control of transcriptional regulatory elements from sterigmatocystin（ST）gene cluster in Aspergillus nidulans, transferring them into A.nidulans, and expressing them. By expressing the genes of one pathway in various combinations, we will clarify the biosynthetic pathway and identify new compounds. Our project will allow the development and application of SMs from the marine Aspergillus sp. strain, and facilitate the biosynthetic research on marine fungal SMs.

海洋真菌次级代谢产物资源丰富，但其生境特殊，难以人工模拟，在现有培养条件下多数次级代谢合成基因簇沉默或低表达。生物合成方法是海洋微生物次级代谢产物资源开发的重要手段，其难点在于缺少成熟的分子操作体系。申请人前期已对一株自己分离的海洋曲霉进行了全基因组测序和注释，从中挖掘出了10个非核糖体多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases, NRPS）生合成基因簇。在此基础上，本项目拟利用酵母重组技术构建基因簇表达盒，应用构巢曲霉杂色曲霉素sterigmatocystin基因簇的转录调控元件，在构巢曲霉异源表达该海洋曲霉的NRPS基因簇，以期发现新型化合物及关键酶活反应，揭示其生合成途径。该项目的开展将为开发该类海洋曲霉的次级代谢产物资源奠定基础；同时，酵母重组技术和构巢曲霉异源表达体系的应用，为研究海洋真菌次级代谢产物提供新的思路和方法。

海洋真菌次级代谢产物资源丰富，但其生境特殊，难以人工模拟，在现有培养条件下多数次级代谢合成基因簇沉默或低表达。生物合成方法是研究、开发海洋微生物次级代谢产物资源的重要手段，但大多数海洋真菌缺少成熟的分子操作体系，无法直接应用基因敲除、转录因子调控等技术进行研究，而应用异源表达体系是目前较为有效的方法。.在已去除杂色曲霉素（sterigmatocystin，STC）等几个主要次级代谢产物生合成基因簇的构巢曲霉表达系统基础上，本项目构建硝酸盐诱导的niiA/niaD(p)启动子调控STC转录因子aflR及其增强子aflS表达的构巢曲霉异源表达体系，验证后得到STC 基因簇的25个启动子中有8个可用于异源基因的硝酸盐诱导表达；通过已知生合成基因及基因簇的验证，证明该改进的构巢曲霉异源表达系统在多种真菌生合成基因簇方面的应用性，为高效进行真菌次级代谢产物生合成基因簇的研究提供新的思路与策略；另外，项目组对海蟑螂肠道分离获得的一株海洋曲霉属真菌进行全基因组的生物合成基因簇挖掘和多种培养基发酵的次级代谢产物分析，预测该基因组中含10个非核糖体多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases, NRPS）生合成基因簇，经转录组分析发现，在常规实验室培养条件下，仅有少数NRPS有表达，结合全基因组基因簇挖掘和转录组分析，对10个NRPS基因簇的边界、底物及可能产物进行预测；之后，通过酵母同源重组技构建这10个NRPS基因的异源表达基因盒，在改进的构巢曲霉系统成功表达，但其中只有2个可获得相应的化合物；对其中1个可获得化合物的NRPS基因簇中的非骨架蛋白基因进行分析，并通过酵母同源重组技术构建一个含该基因簇中4个相关基因的硝酸盐诱导表达基因盒，这4个基因只在硝酸盐诱导条件下表达，其相关的化合物在大量发酵和结构解析中。通过以上研究，该项目为开发该类海洋曲霉的次级代谢产物资源初步奠定基础，并应用所改进的硝酸盐诱导表达的构巢曲霉体系研究该类海洋曲霉的NRPS基因簇，为缺少分子操作体系的海洋真菌次级代谢产物研究提供新的思路和方法。