枯草芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的高产机理研究

生物合成的γ-聚谷氨酸（γ-poly-glutamic acid，γ-PGA）是一种具有广阔应用前景的多聚氨基酸高分子聚合物，但由于当前γ-PGA的生物合成产量低、生物合成机制不完全清楚等因素，制约了γ-PGA的生产与应用。在我们多年研究微生物生产γ-PGA的基础上，利用蛋白质二维电泳分离我们的枯草芽孢杆菌γ-PGA高产专利菌株和出发菌株的差异表达蛋白，采用质谱鉴定，并在体外分析差异表达蛋白的功能作用，探明枯草芽孢杆菌合成γ-PGA的高产机制，同时利用差异表达蛋白构建γ-PGA高产菌株高效筛选方法和γ-PGA合成基因高效表达工程菌株，为γ-PGA高产菌株的选育和代谢调控提供依据，从而促进γ-PGA产业的发展。

聚γ-谷氨酸 (poly-γ-glutamic acid，以下简称γ-PGA) 是一种由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式聚合而成的生物高分子聚合物，在工业、农业、医学、环保等领域有重要的应用价值。. 通过对枯草芽孢杆菌B6-1和w003 的发酵特征分析，表明菌体的生长和γ-PGA的合成不是同步的，属于部分生长偶联型。建立了枯草芽孢杆菌蛋白样品的预处理方法，用超声波破碎仪破碎细胞，细胞破碎液用三氯乙酸-丙酮法纯化，得到用于双向电泳的蛋白样品。采用17cm长度的胶，胶浓度12%，pH 范围在4.0-7.0，等电聚焦时间53000vh，在此双向电泳条件下可以完成枯草芽孢杆菌合成γ-PGA的蛋白差异分析。 . 通过蛋白质双向电泳，枯草芽孢杆菌W003和B6-1能够检测到的蛋白点分别是1240和1056。，其中菌株W003中比B6-1的表达量高的点有163个，而菌株B6-1中比W003中表达量高的点有69个。从W003高表达的蛋白点中选取了79个表达丰度较高的蛋白点，进行MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定，得到77个蛋白。差异蛋白功能分类分析表明，与氨基酸代谢和转运相关的蛋白，与碳水化合物转运和代谢相关的蛋白，与核酸转运和代谢相关的蛋白这三个功能分类占了差异蛋白的绝大多数。 .通过双向电泳结合qRT-PCR以及代谢分析，研究了氯化钠对地衣芽孢杆菌WX-02合成γ-PGA的影响，得到169个差异蛋白点，其中89个不同蛋白质得到鉴定。蛋白功能类别分析发现，高浓度氯化钠会促使跟蛋白质翻译后修饰相关的蛋白、跟能量生成及转换相关的蛋白以及糖酵解途径和溢流代谢相关的蛋白得到诱导或表达上调，同时也会促使参与辅酶或者辅基代谢的蛋白表达发生显著变化。. 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌有类似的盐适应机制，通过抑制多数辅酶或辅基的代谢以较低的生长速率来适应高盐环境；同时也能使菌体提高自身合成谷氨酸和外源谷氨酸的供应，最终增强γ-PGA的合成。这项研究有助于我们深入地理解芽胞杆菌生长与γ-PGA合成之间的关系，为有关γ-PGA的代谢工程研究提供指导。