组织蛋白酶L对海参自溶的调控方式及其靶蛋白的生物信息

海参是一种自溶能力极强的海洋生物，这一特性给海参的保鲜、贮藏、运输和加工带来诸多不便。研究发现，海参自溶作用主要表现为蛋白质的降解，组织蛋白酶L参与海参的自溶过程。然而，组织蛋白酶L是以何种方式促使海参蛋白质降解，作用的靶蛋白具有哪些生物学特性，目前仍未明确。针对这两个问题，本项目拟从基因水平上揭示组织蛋白酶L调控海参自溶的方式，并分析其靶蛋白的生物信息。首先，利用紫外线诱导海参自溶模型，结合RT-PCR技术，确立组织蛋白酶L基因表达与海参自溶程度的相关性；其次，应用外源的钙蛋白酶和酸性磷酸酶以及它们抑制剂，建立双酶主导的海参自溶模型，明确两种酶对组织蛋白酶L是否具有协同作用，揭示组织蛋白酶L基因对海参自溶的调控方式；最后，采用SDS-PAGE及质谱分析组织蛋白酶L基因的靶点蛋白，获得肽指纹图谱，利用蛋白质数据库及生物软件分析靶点蛋白的生物信息。从而，为揭示海参自溶的机理奠定理论基础。

海参是一种自溶能力极强的海洋生物，这一特性给海参的保鲜、贮藏、运输和加工带来诸多不便。本项目从基因水平上揭示组织蛋白酶L 调控海参自溶的方式，并分析其靶蛋白的生物信息。首先，从基因表达层面和食品层面，建立了紫外线、温度诱导的海参自溶模型。从基因表达层面出发，固定紫外线照射强度（58 μW/cm2），在25 ℃下进行照射，时间控制在6 h以内。在此条件下，活体海参可发生显著的自溶，且仍处于存活状态，不影响内标基因细胞色素B的表达。从食品层面出发，以三氯乙酸（TCA）可溶性寡肽的溶出量为指标，分析海参的自溶过程中温度和pH的交互作用。依据响应面分析，海参体壁适宜自溶条件为温度46.3℃，pH6.1；而海参肠适宜自溶条件为温度48.3℃，pH4.4。其次，明确了组织蛋白酶L与海参自溶的相关性及作用方式。采用RT-PCR方法，在25℃下，紫外线（58 μW/cm2）照射30 min，海参肠中组织蛋白酶L表达量显著上调，乙酰胆碱酯酶表达量显著下调，说明二者在转录水平上参与海参自溶。同时，发现组织蛋白酶L在海参自溶过程中酶活显著提高，并且组织蛋白酶B的酶活也显著提高，而碱性磷酸酶的活力却显著下降，提示二者也可能参与自溶过程。此外，研究发现，海参体壁胶原蛋白具极端不溶性。利用SDS和尿素溶液提取海参体壁总蛋白，经电泳分析并不能获得胶原条带，而得到两种主要的非胶原蛋白，分子量分别为200 kDa和44 kDa。组织蛋白酶L抑制剂——反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷、碘乙酸、抗痛素以及食品级组织蛋白酶L抑制剂——乳清蛋白浓缩物均可有效的抑制自溶过程中非胶原蛋白的降解。说明组织蛋白酶L以直接降解非胶原蛋白的方式参与海参自溶。最后，明确了组织蛋白酶L的作用靶点蛋白的生物信息。利用三重四极杆液质联用仪（LC- MS/MS）鉴定靶点蛋白分别为主要卵黄蛋白和肌动蛋白。此外，针对海参肠自溶的特点，对组织蛋白酶L参与降解的海参肠自溶寡肽进行了序列分析。以上研究成果发表SCI收录论文7篇，中文核心期刊论文4篇，会议论文2篇，获得中国授权发明专利1项，培养博士研究生1名、硕士研究生4名，为揭示海参自溶机理奠定了研究基础。