洋葱T型细胞质雄性不育线粒体coxⅠ重组基因的分子机制研究

We had conducted some studies on the T-type cytoplasmic male sterility in onion that, the CMS marker of orfA501 ,covered by putative orf217, is located at the down stream of coxⅠ, they share a short piece of sequence containing 154 bases, and the orf217 maybe play a positive role in the transcription of coxⅠ-mRNA，who lose 3'-UTR ; there are three coxⅠ transcrpts in both sterility and fertility lines with the same 5'-UTR and open read frame, but the length of 3'-UTR is diversity. In order to study further about the molecular mechanism in onion T-CMS, we are intend to conduct mainly from three aspects: (1) determinate transcript model of recombinant gene, coxⅠ- orf217. (2) study editing feature of coxⅠ. (3) study the effects of Ms on coxⅠ- orf217.

项目申请人在以前的研究中发现，洋葱T型细胞质雄性不育分子标记orfA501片段所在的阅读框（orf217）与细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（coxⅠ）基因的3' 端有154个碱基的重叠；在小孢子发育后期orf217的转录对缺乏末端非翻译区的coxⅠ-mRNA的转录可能存在正调控作用；不育系和可育系中都存在3种不同大小的coxⅠ mRNA，它们的5'端非翻译区（5'-UTR）和开放阅读框碱基序列完全相同，只是末端非翻译区（3'-UTR）长度不同；不同长度的mRNA在保持系和不育系中的转录丰度有差异。为了进一步研究该重组基因的分子机制，本项目拟从以下3方面进行：（1）确定coxⅠ- orf217重组基因转录方式。（2）研究coxⅠ 编辑特点。（3）研究恢复基因对coxⅠ- orf217的影响。

细胞色素氧化酶是线粒体膜电子传递链中不可缺少的复合体之一，COX I蛋白是其中的一个亚基。申请人曾发现了洋葱T-CMS线粒体cox I基因重组。在研究该重组基因的全长及其表达的过程中，发现重组基因好像是分别表达的，这与在其它作物CMS中发现的重组基因表达方式不同。.本研究主要进行洋葱小孢子发育进程以及T-CMS不育系中的败育途径研究。通过三年的研究，我们掌握了洋葱花球外部形态与花粉发育时期的对应关系；洋葱T-CMS不育系和保持系造孢组织时期小孢子的生长发育没有明显差异，不育系花药绒毡层在花粉母细胞时期就与中层完全分离，并逐渐膨大挤压花粉母细胞，最后逐渐降解。其降解后的残余物侵入药室，与小孢子混合粘连在一起，占据药室的一部分空间，并且不能供给小孢子生长发育所需要的营养物质，最终小孢子降解，花药败育；花粉粒成熟早期不育系小孢子中线粒体体积变小，结构异常，基质透明度增加，内外膜破损，而此时保持系和恢复系小孢子中线粒体处于正常水平，说明洋葱T-CMS的产生可能与线粒体有关；在整个花药发育过程中，保持系和恢复系的花蕾ATP含量均无显著差异。不育系花蕾ATP含量在各时期均显著低于保持系和恢复系，可能是导致其雄性不育的原因；cox I重组基因在各个时期的花蕾中都有表达，为组成型表达，而cox I重组基因在洋葱T-CMS花蕾不同发育时期的表达均明显低于保持系和恢复系；采用荧光定量PCR技术对cox I基因在洋葱T-CMS不育系、保持系和恢复系的相对拷贝数进行测定，三系的cox I基因拷贝数差异不显著，即三者拷贝数相同，结果排除了cox I在RNA水平表达量不同是由于三系拷贝数不同的可能性；不育系中含有较多的短3’-UTR cox I-3片段，而保持系和恢复系中基本检测不到该片段，较短的3’-UTR会造成mRNA容易被降解，这极有可能是造成不育系coxI基因功能缺失的原因；成功克隆到了洋葱ATP6的部分片段。采用RACE方法从不育系和保持系中克隆到了cox I基因全长，经过序列对比发现，二者5’端序列以及开放阅读框序列完全相同，只是在3’末端有差异，即保持系比不育系长127个碱基，不育系最末端的20个碱基与保持系相同位置的碱基差异很大。.本研究结果可帮助科学家更深入的了解洋葱核质基因之间的相互关系，为工程雄性不育、分子设计育种以及从根本上解决由细胞质基因变异导致的病害提供理论。