低氧预处理调控牙周膜干细胞分化的策略和机制研究

The loss of cell differentiation ability after transplantation is a key obstacle in clinical application of periodontal ligament stem cells (PDLSCs). Our previous studies have found that short-term hypoxic preconditioning significantly enhanced the PDLSC osteogenic differentiation potential and promoted periodontal tissue regeneration, suggesting the advantage of hypoxic preconditioning strategies in periodontal tissue engineering. However, the effect of hypoxic stimulation on PDLSCs differentiation is due to both the concentration and time, the optimal condition and the underlying mechanism remains unclear. Recent studies suggest that Circcular RNA (circRNA) plays an important role in the PDLSC differentiation regulated by hypoxic stimulation, which deserves further study. On the basis of previous work, we set different hypoxic concentrations and time points via orthogonal experiments in this project, aiming to comprehensively screen the optimal condition for improving PDLSC differentiate potential in 3D culture system. The high-throughput sequencing was used to identify the differential expression of circRNAs in cells. The bioinformatic analysis and molecular biotechnology were used to explore its potential "hypoxic-microRNA-ceRNA-mRNA-differentiation" network. This project can provide feasible pretreatment strategies for periodontitis cell therapy, and provide new ideas and experimental basis for the underlying mechanism.

移植后细胞分化能力减弱，是牙周膜干细胞（PDLSCs）临床应用亟需解决的关键问题。前期研究发现，短时低氧预处理显著增强PDLSCs的骨向分化潜能，促进牙周组织再生，提示建立、优化低氧预处理策略成为可能。然而，低氧刺激对PDLSCs分化的影响具有浓度和时间双重性，最佳作用条件尚不明确，且机制尚未阐明。最新研究提示，环状RNA（circRNA）在低氧刺激调控PDLSCs分化过程中可能发挥重要作用，值得深入研究。因此，本实验拟在前期工作基础上，通过正交设计不同刺激条件，在三维培养体系中全面筛选用于移植PDLSCs的最佳低氧预处理条件；通过高通量测序，明确低氧预处理前后细胞差异表达circRNAs；通过生物信息学分析和分子生物学手段，阐明“低氧-microRNA-ceRNA-mRNA-分化”调控网络。本项目可为牙周炎细胞治疗提供切实可行的预处理策略，同时为相关机制研究提供新的思路和实验基础。

移植后细胞分化能力减弱，是牙周膜干细胞（PDLSCs）临床应用亟需解决的关键问题。该项目探索通过短时的低氧预处理策略，显著增强PDLSCs的骨向分化等生物学潜能，促进其体内牙周组织再生，且对低氧刺激调控PDLSCs生物学功能的作用机制进行了深入研究。在该项目的资助下，负责人共发表论文10余篇，其中以通讯/第一作者在Bioact Mater、Front Genet、Int J Oral Maxillofac Implants、Int J Oral Max Surg等杂志上发表SCI论文4篇，均标明NSFC（81901010）资助。获中华口腔医学会科技奖二等奖1项，在申请发明专利1项。项目负责人于2020年获聘泰山学者青年专家，联合培养硕士生3名、博士后1名。项目组成员多次参加口腔及组织再生学术会议汇报研究成果，获得同行专家一致认可与好评，主要内容如下：.（1）筛选出短时的低氧预处理（2%O2、24 h）条件，能够改善PDLSCs成骨分化、增殖、迁移等功能；显著促进细胞形成膜片；膜片移植入前期成功构建的牙周组织缺损，结果表明低氧预处理后的细胞在牙周组织缺损区域再生出的骨组织更多，且能实现类牙骨质和类牙周膜样组织的再生。.（2）对低氧预处理前后 PDLSCs 中的 mRNAs 进行了高通量测序和生物信息学分析。筛选出与细胞增殖、迁移、分化、免疫等生物学功能密切相关的5个关键基因（VEGFA、 IGFBP3、 LEP、 SLC7A11、 DR1）并进行了验证。初步阐释了低氧预处理调控PDLSCs生物学功能的分子机制。.（3）鉴于近年来的研究表明，移植干细胞促组织愈合和再生的作用，主要是通过其旁分泌功能实现的，其中外泌体（EXs）起着至关重要的作用。采用筛选出的预处理策略，开展了PDLSC-EXs调控细胞生物学功能及其内在分子机制的研究。发现低氧预处理同样能够增强PDLSC-EXs的分泌与促组织再生潜能。.总之，本项目深入探索了低氧预处理对PDLSCs生物学功能的影响及其相关作用机制，为牙周炎细胞治疗提供了切实可行的预处理策略，同时为相关机制研究提供新的思路和实验基础。