基于家蚕昼夜节律生物钟信号途径基因发掘的滞育诱导授时信号输入机制研究

生物钟信号途径与生物代谢和功能调控的联系是目前备受关注的热点，其温度授时作用机制远远落后于光照授时机制研究，关键原因是缺乏理想的实验平台。滞育是昆虫的基本生理现象，是影响蚕业生产和害虫防治的重要性状。生物钟信号途径是家蚕滞育和活化控制的初始信号通路，家蚕滞育是研究温度授时因子作用机制的理想性状。申请项目在构建的12个家蚕SAGE文库基础上，成功发掘和克隆了家蚕生物钟信号途径的所有钟基因。基于此，本项目将首先利用光照授时处理方法，鉴定克隆的家蚕昼夜节律生物钟核心钟基因；进一步建立光照授时信号输入控制关键基因的转基因家蚕系统，研究家蚕生物钟信号途径的（基因）网络骨架，鉴定家蚕滞育诱导发生温度的生物钟信号输入途径的关键基因，研究滞育诱导温度和蚕卵活化温度的信号途径；探讨建立基于家蚕滞育性状的昆虫温度授时生物节律分子机制研究平台。

项目背景：生物钟信号途径与生物代谢和功能调控密切相关，其温度授时作用机制远远落后于光照授时机制研究，关键原因是缺乏理想的实验平台。滞育是昆虫的基本生理现象，是影响蚕业生产和农业害虫防治的重要性状。生物钟信号途径是家蚕滞育和活化控制的初始信号通路。诱导家蚕滞育卵活化的是温度授时信号，而诱导家蚕卵滞育的则是亲代卵孵化后期的温度和光照这二个授时因子，并且温度的影响显著大于光照。家蚕滞育是研究温度授时因子作用机制的理想性状。.主要研究内容：挖掘、克隆和鉴定家蚕生物钟信号途径相关基因，研究其相互作用（网络骨架）；建立授时信号输入途径关键基因敲降或敲除系统，研究滞育诱导发生的温度信号传递途径。.重要结果及其科学意义：（1）包括家蚕的鳞翅目昆虫生物钟环路的核心成员，在蛋白质分子进化和相互作用等方面，与哺乳类甚至与果蝇和线虫等经典模式动物有很大差异，相关研究几乎是空白。项目在前期构建的12个家蚕SAGE文库基础上，系统发掘和克隆了27个家蚕生物钟相关基因，鉴定了所有的核心钟基因。首次构建了基于实验验证的光授时因子在家蚕生物钟负反馈环路的分子间信号传递模式，即黑暗条件下细胞核中CLK/CYC蛋白二聚体结合核心钟基因启动子E-box，激活并促进Cry2、Per和Tim的转录和翻译产物CRY2、PER和TIM在细胞质中的蓄积。受光照刺激，作为光感受器的CRY1接收信号，结合PER并促进其被DBT磷酸化活性，然后PER结合CRY2协同进入细胞核；并进一步结合CLK/CYC二聚体，抑制核心钟基因的转录。TIM蛋白则通过受光节律调节的细胞核质中含量快速变化，竞争性结合CRY2蛋白，调节核内CRY2对核心钟基因的转录抑制。建立了有别于果蝇和蜜蜂的鳞翅目昆虫昼夜节律信号途径研究平台。（2）完成了诱导家蚕滞育发生温度和光照授时信号输入处理方法与技术研究。进一步研究了响应家蚕滞育诱导发生温度（光周期）的生物钟信号输入途径的关键基因；实验证实了光周期依靠细胞的昼夜节律生物钟负反馈途径，通过影响胚胎的内分泌蜕皮激素作用途径，调控了家蚕卵的孵化节律。（3）建立了授时信号输入途径关键基因对代谢影响的高效研究平台，利用TALEN基因组编辑技术，构建了Per、Tim、Cry1和Cry2基因敲降系统，进一步通过代谢组学方法证明了Per基因通过能量代谢通路对生长发育的影响。