家蚕滞育激素受体信号转导及对胚胎滞育调控的机理研究

As an important model insect, Bombyx mori is diapaused in egg stage. The initiation of egg diapause depends on the effect of diapause hormone (DH) which is mediated by diapause hormone receptors (DHR), it is essential to interpret the mechanism of DH through studying DHR. In our previous study, we have cloned DHR's gene, understood the coupling relationship between DHR and G protein and established a stable DHR expression system in cell and the methods to determine receptor-ligand binding and functional activity. Based on those studies, this project aims to explore the mechanism of DHR signal transduction and that on regulation of embryo diapause in Bombyx mori by the following studies on DHR: signal transduction pathway and its molecular mechanism, endocytosis and intracellular transport mechanism, structure-activity mechanism, DHR's expression profiles at difference voltinisms and development stages and their relationship with embryo diapause initiation. The breakthrough of this basic research could help us to understand the mechanism of DH's action and the molecular mechanism of the whole diapause process including induction, inhibition and termination. And it could also provide theoretical basis for further utilization of embryo diapause and renovate the traditional technology of sericulture. Furthermore, it could contribute to the promotion of research progress in the field of G protein coupled receptor of insect.

作为重要模式昆虫的家蚕为卵滞育型，其滞育发生取决于滞育激素（DH）作用，而DH作用是通过滞育激素受体（DHR）来介导的，研究DHR对于解明DH作用机制是必要的。本项目在我们克隆了DHR基因、了解了DHR与G蛋白的偶联关系、建立了家蚕DHR稳定表达系统以及受体配体结合活性和功能活性检测方法等的前期研究基础上，通过家蚕DHR信号转导通路及其分子机制、DHR内吞和胞内转运机制、DHR结构与功能的构效机制、DHR在不同化性和不同发育时期蚕体中表达谱及其与家蚕胚胎滞育发动的相互关系等研究，探明家蚕DHR信号转导及对家蚕胚胎滞育调控的机理。这一基础问题的突破，有助于在本质上认识和了解家蚕DH的作用机制，为全面解明家蚕胚胎滞育诱导、阻止、解除全过程的分子机理作出贡献；可为进一步利用家蚕胚胎滞育，进行传统养蚕业的技术提升等，提供很好的理论基础；可为推进我国昆虫G蛋白偶联受体领域研究进展，贡献出一定力量。

家蚕为卵滞育型昆虫，其滞育发生取决于滞育激素（DH）作用，而DH作用是通过滞育激素受体（DHR）来介导的，研究DHR对于解明DH作用机制是必要的，但国内外对家蚕DHR的研究一直滞后。本项目通过家蚕DHR的信号转导、构效、胚胎滞育调控机理等系列研究，克隆出了家蚕DHR基因并查明了其定位表达特性；家蚕DHR通过与Gq蛋白偶联来激发细胞cAMP水平提高和Ca++释放，同时引起ERK1/2磷酸化水平增加，从而将胞外信号跨膜传递到胞内，这一信号转导过程在PLC/Ca++/PKC的参与下完成；Gβγ亚基、PI3K参与DHR介导的ERK1/2磷酸化；家蚕DHR在DH刺激下快速内吞，呈现明显的时间和浓度依赖性，其内吞需要招募协助蛋白β-arrestin1/2到细胞膜上；DH近C端的6个氨基酸在激活DHR进行信号转导中起着重要作用，是其核心作用序列；在DH的24个氨基酸序列中，Arg24、Leu23对激活DHR信号转导最为关键，其次为Trp19、Phe20、Pro22，再次为Gly21；不同化性品种及不同外界因子下的家蚕DHR基因表达水平呈现出与滞育发动相关联的特征性波动，给多化性品种蚕蛹体注射DH可引起蚕卵滞育，给一化性品种蚕蛹体注射家蚕DHR dsRNA可显著地阻断家蚕DHR信号转导而引起蚕卵非滞育，给蚕蛹体注射Gq抑制剂UBO-QIC和MEK1/2抑制剂U0126可显著阻断家蚕DHR介导的ERK1/2磷酸化，从而影响DHR转导DH信号引起的蚕卵滞育；从家蚕幼虫脑中克隆得到了BmTKRPR基因，BmTKRPR对家蚕幼虫摄食、生长发挥调控作用，从而影响后期的胚胎滞育；从家蚕中克隆得到了家蚕Kurtz蛋白，在5龄蚕脂肪体组织中高表达，具有保守的Clathrin蛋白结合区域和Src同源结构域，家蚕DHR等GPCRs内吞需要招募kurtz蛋白到细胞膜上，并且kurtz能拯救因β-arrestin1/2缺失而产生的内吞抑制，kurtz作为家蚕GPCRs内吞的主要调控因子，在家蚕GPCRs信号通路中发挥着非常重要的作用，这一新发现为研究家蚕能量物质代谢及其调控机制开辟了新领域。项目研究成果的取得，对于在本质上认识和了解家蚕DH作用机制以及DHR在胚胎滞育诱导、阻止、解除全过程中调控机理等，具有重要的科学意义，同时对于推进传统养蚕业的技术提升、提高经济效益等，也将产生积极的作用。