氧化还原信号ROS影响家蚕卵滞育的分子机制研究

Silkworm is a classical model for studying the egg diapause. In order to meet the demands of rearing，diapause is often prevented by HCl-treatment in sericultural industry. However, the molecular mechanism has not yet been elucidated until now. The aim of this study is to reveal the molecular mechanism of diapause prevention with high concentration of O2 and HCl treatment. On the basis of the transcriptional results, the key factors of diapause prevention, O2 and redox signal molecule ROS, was found in our previous result. In order to studied more details of diapause prevention, the following work will be continued, that include: 1) Silkworm embryo will be investigated and physiological states of different developmental stages will be analyzed to under different concentrations of O2. 2) The difference will be investigated on ROS and GSSG/GSH between the diapause prevented eggs and diapause status eggs. Oxygen free radical inhibitor NAC will be employed to verify the role of ROS. 3) FoxO signaling pathway will be studied to screen genes related to diapause, and molecular regulatory network of diapause prevention will be constructed according to our results. This work will not only provide more understanding for molecular mechanism of diapause prevention, but also provide a reference for the analysis of the whole diapause mechanism.

家蚕是研究卵滞育的经典模式昆虫。根据养蚕需求，生产上经常通过即时浸酸方法来阻断滞育，但蚕卵阻断滞育的分子机理一直未能阐明。本项目以揭示蚕卵阻断滞育分子机制为目标，采用高浓度O2和HCl阻断滞育，在转录组学研究结果的基础上，对阻断滞育的关键因子O2及氧化还原信号分子ROS开展深入研究。主要内容包括：1）采用不同浓度O2处理蚕卵，并对蚕卵胚胎形态等生理状态进行观察，验明O2在蚕卵胚胎发育中的关键作用；2）调查O2在生物体内的形式ROS、GSSG/GSH在发育和滞育蚕卵的含量差异和变化趋势，并利用氧自由基抑制剂NAC等对ROS在蚕卵滞育和发育过程中的作用进行验证；3）重点关注受ROS诱导的FoxO信号通路，筛查与卵滞育相关的基因，初步构建阻断滞育的分子调控网络。该研究不仅为阻断滞育机理的研究提供了新的思路，也将为整个滞育机理的解析提供参考。

家蚕是一种重要的经济昆虫，在我国有着5 000年的饲养历史，家蚕也是一种典型的卵滞育昆虫，蚕业生产上通常采用HCl 法来阻断滞育，使蚕卵进入活化状态按照人们的需要生长发育。但是迄今为止，蚕卵阻断滞育的分子机理一直未能阐明。.本研究通过三气培养箱在常温常压下高浓度氧气处理二化性实验品种滞育卵，获得了氧气有效阻断蚕卵滞育的最佳条件为产后 20 h用体积分数为70%的氧气处理40 h，高氧法对蚕卵在孵化率、孵化时间上都与 HCl 法有相近的阻断滞育的效果。将该处理方法应用于一化性品种、二化性生产品种和转基因注射滞育蚕卵均能有效阻断滞育。同时，采用低浓度氧气处理家蚕发育卵，发现当氧气浓度下降到一定范围时胚胎的发育受到抑制，说明可以通过氧气浓度高低调节蚕卵胚胎的发育。接下来，通过对氧气在生物体内的形式ROS研究，发现在决定蚕卵胚胎发育方向的关键时期滞育蚕卵和发育蚕卵在ROS含量上差异显著，滞育卵出现较高浓度的ROS进入滞育。利用RNA-seq对家蚕滞育卵进行测序，分析发现ROS作为一种重要的氧化还原信号，诱导途径主要集中在能量代谢通路上。其中Insulin/FoxO 信号途径中基因在滞育卵和非滞育卵中存在显著差异，FoxO基因在产后0-2 d滞育卵中的表达量显著高于非滞育卵，FoxO蛋白在产后0-9 d 滞育卵中的表达量高于非滞育卵。至此，高氧法阻断蚕卵滞育是可行的，在蚕业生产上相比于传统的HCl法具有环境友好的优势；在转基因家蚕蚕卵制备上，为阻断转基因家蚕卵滞育提供了一种高效简便的方法，有利于转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊的家蚕品种。氧气体内转化形式ROS作为一种重要的氧化还原信号，诱导的途径主要集中在能量代谢通路上，这为更好的理解家蚕胚胎滞育提供了有价值的参考，为下一步推进家蚕滞育机理的功能研究起到了十分重要的作用。相关研究工作的成果已在Ann Entomol Soc Am、华南农大学报、Int. J. Mol. Sci.、IBMB等期刊发表学术论文5篇，获授权专利1项。.