猪瘟病毒NS2蛋白的致细胞病变作用及其分子机理的研究

猪瘟病毒（CSFV）NS2蛋白具有自身蛋白酶活性，在宿主细胞因子参与下其将NS2-3聚蛋白切割为NS2蛋白和NS3蛋白单体，这种自我酶解作用对CSFV RNA的复制必不可少，而且与病毒的致病性直接相关，但NS2蛋白单体对宿主细胞有何影响并不清楚。我们首次发现CSFV NS2蛋白在猪血管内皮细胞中表达会引起细胞发生病变和死亡，且病变和死亡细胞具有凋亡细胞的形态学特征。本项目将CSFV NS2基因分别转入猪、牛、羊细胞中进行表达，弄清NS2蛋白致病细胞变作用是否具有宿主种属和细胞类型嗜性的差别，探索该蛋白表达早期对猪血管内皮细胞增殖与代谢的影响和表达后期引起细胞凋亡的途径，采用基因缺失手段查明NS2蛋白中触发细胞凋亡程序的功能区，并应用酵母双杂交技术寻找与该功能区发生相互作用的细胞分子，以期揭示CSFV NS2蛋白引起细胞凋亡的分子机制，为阐明猪瘟病毒的致病机制提供新的科学资料。

本项目基本完成了原计划的研究内容，还增加了一些研究内容。采用RT-PCR方法成功扩增到了猪瘟病毒（CSFV）NS2基因，得到12个亚克隆，开展了NS2 蛋白的亚细胞定位、降解特性、对宿主细胞周期与增殖的影响、对宿主细胞炎症因子表达的调控以及NS2蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的筛选等方面的研究。结果表明，NS2蛋白定位于细胞内质网，至少含有2个内部信号肽序列、4个跨膜区；NS2蛋白通过蛋白酶体途径快速降解，这一降解过程可以被特异性的蛋白酶体抑制剂MG132所抑制；NS2蛋白对宿主细胞的增殖活性具有一定的抑制作用，诱导宿主细胞周期阻滞于S期，但并不是通过诱导细胞的凋亡来抑制细胞的增殖；NS2蛋白能够引起宿主细胞内质网应激反应，激活核转录因子NF-кB来诱导血管内皮细胞中白介素8（IL-8）和整合素（integrin）β3的表达上调，并且CSFV NS2蛋白的表达能够对抗蛋白酶体抑制剂MG132对NF-кB的活性和IL-8表达的影响；表达CSFV NS2蛋白的细胞表现出对MG132诱导细胞凋亡作用的抗性；CSFV NS2蛋白能够上调宿主细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。通过酵母双杂交技术筛选到11个与NS2蛋白相互作用的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）蛋白，分别为GOPC、HNRNPH1、DNAJA1、ATP6、CSDE1、CNDP2、FANCL、TMED4、DNAJA4、MOAP1和PNMA1，其中，GOPC、TMED4、DNAJA1、DNAJA4和CSDE1参与蛋白从高尔基体到内质网的转运、加工以及应激；FANCL和ATP6参与泛素介导的蛋白水解过程；MOAP1、PNMA1和ATP6参与细胞凋亡通路。这些筛选到的蛋白与NS2蛋白对宿主细胞功能影响密切相关。.综上所述，本项目确定了NS2蛋白的亚细胞定位和降解特性，揭示了该蛋白对细胞周期与细胞增殖的调控机制，明确了CSFV NS2蛋白的表达对趋化因子IL-8、integrin β3、抗凋亡蛋白Bcl-2表达的调节作用与机制。本项目所取得结果为阐明CSFV NS2蛋白在致病中的作用和认识CSFV的分子致病机制提供了一些新的理论资料。