羊红细胞膜上泰勒虫受体的发现与鉴定

我国羊泰勒虫病是由尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫感染绵羊和山羊引起的血液原虫病，它们的传播媒介为青海血蜱和长角血蜱。该病在我国西北地区广泛分布，危害严重。羊泰勒虫是红细胞内寄生虫，其病原入侵、胞内寄生、致病和免疫逃避的分子机制尚不清楚，因此，挖掘和鉴定病原宿主相互作用的关键分子对揭示这些机制至关重要。本研究拟以近年来从尤氏泰勒虫红细胞阶段的裂殖子cDNA文库中获得的羊泰勒虫特异性蛋白和已制备的单克隆抗体为基础，通过利用生物大分子相互作用系统、免疫沉淀等技术，从红细胞膜蛋白混合物中捕获与羊泰勒虫特异蛋白相互作用的受体，采用质谱分析、共聚焦显微镜检测方法和原位杂交方法等，鉴定这些受体分子的结构和验证其功能，找到病原宿主相互作用的切入点，揭示它们在病原入侵、胞内寄生、致病以及免疫逃避上的作用机制，为针对性的研制羊泰勒虫新型分子疫苗和药物靶标奠定基础。

本项目计划通过免疫学筛选羊的泰勒虫cDNA文库，获得羊泰勒虫特异性基因，通过生物信息学分析，筛选出寄生虫入侵相关的配体分子，对其进行克隆表达，制备单克隆抗体；通过利用分子生物学和免疫学实验技术，获取与寄生虫入侵相关配体分子相互作用的宿主动物红细胞受体，并共定位为这些分子在感染的红细胞中的分别规律。总的来说，在泰勒虫特异基因的研究上进展良好。研究采用分子生物学实验技术，获得了尤氏泰勒虫Tu88，TuIP两个具有抗原性的分子，获得了吕氏泰勒虫TlSP抗原分子。系统研究了这些分子的结构特征和免疫学特性，在真核细胞中定位Tu88和TlSP发现它们分布在细胞浆中；通过重组TuIP免疫实验动物，发现免疫动物对羊泰勒虫的攻击具有保护作用，免疫动物的染虫率降低，感染时间延迟；通过利用环形泰勒虫裂殖子体外成功接种羊的红细胞，首次建立泰勒虫在红细胞中的体外培养体系，为开展病原与宿主细胞相互作用研究打下了基础。本项目有待进一步开展病原入侵相关宿主细胞受体分子鉴定工作。这部分工作进展缓慢的主要原因是采用的免疫学筛选方法为低通量方法，尽管获得的泰勒虫特异性分子都是重要的抗原分子，但这些分子并不是参与病原入侵的关键分子，即不是病原入侵宿主红细胞的配体分子。另外，宿主红细胞的膜蛋白的获得和纯化难度较大。本项目已经启动了吕氏泰勒虫基因组研究，通过高通量的测序，将预测一批泰勒虫入侵相关的分子，对这些分子有选择的开展功能研究，将有望获得病原入侵相关的配体分子和宿主红细胞受体分子。总体来说，本项目完成了预期目标中的大部分任务。这包括获得了Tu88、TuIP和TlSP三个羊泰勒虫特异抗原性基因，制备了相关生物学材料，包括抗原，抗体，用Tu88和TlSP分别建立了ELISA诊断方法，用重组蛋白TuIP进行了羊泰勒虫免疫保护试验，为泰勒虫疫苗研制奠定了基础；开展了Tu88和TlSP的功能研究，定位了其在真核细胞中的表达情况。启动了泰勒虫基因组研究，对吕氏泰勒虫进行了全基因组测序，绘制了基因组精细图谱；预测了7000余条基因，为下一步筛选病原入侵相关分子提供了数据支撑。本项目共资助发表论文28篇，其中SCI论文22篇，中文论文6篇；培养博士后1名，硕士研究生3名。项目主持人将继续研究泰勒虫和宿主的相互作用，相关研究成果将致谢国家自然科学基金的资助。.