烟草壳寡糖受体鉴定及其在诱抗过程中的功能确认

壳寡糖是一种有效的植物抗性激发子，已被成功应用于农业生产，但壳寡糖被植物识别的具体机制仍不明了，尤其是直接起信号接收作用的壳寡糖受体尚未见报道。在申请者从烟草质膜上分离得到壳寡糖结合蛋白(COSBP)的基础上，本申请拟利用自主研发的新型荧光探针研究壳寡糖与COSBP的结合性质，从生化角度初步证明COSBP为壳寡糖受体。进一步克隆COSBP基因并构建RNAi植株，检测此转基因植株膜蛋白与壳寡糖的结合能力；再运用多种植物生理病理及分子生物学方法多角度、多指标研究COSBP敲除后烟草中壳寡糖诱抗能力的改变，明确COSBP在壳寡糖诱抗中的具体作用，从生理功能上再次确证COSBP为壳寡糖受体。本申请是植物抗性生理、植物保护与糖生物学领域的交叉工作,实验完成后，将发现植物中的首个壳寡糖受体，可加深对壳寡糖诱抗机理的认识，为寡糖类激发子在植保领域的应用提供理论支撑，也有助于揭示寡糖与蛋白的相互作用规律。

本项目针对在实际农业生产中已有较好应用的糖类诱导子-壳寡糖进行研究工作，发现烟草等植物中壳寡糖结合蛋白，并明确此结合蛋白与壳寡糖的结合方式及受体功能。在项目开展过程中，针对核心研究内容，研究组突破了相关技术、搭建了相关技术平台：高质量无杂质壳寡糖制备技术、不同聚合度壳寡糖单体制备技术平台、壳寡糖偶联亲和色谱材料制备技术、壳寡糖荧光标记探针制备与评价技术、植物膜蛋白分离技术、基因克隆与原核表达技术平台、Real-time PCR结合生物信息学转录水平分析技术、蛋白-多糖/寡糖结合检测技术、分子模拟与对接技术平台等，并通过合作，获得了相关转基因植株。在这些技术和实验材料基础上，本项目实现了预期的成果，这些技术平台也为实验室开展相关工作提供了很好的技术支持。本项目获得的成果如下：获得了大量的高纯度壳寡糖不同聚合度单体；利用亲和层析方法从烟草和拟南芥中发现壳寡糖结合蛋白，其中烟草中壳寡糖结合蛋白（NtCOSBP）大小75kD左右，与报道的几丁寡糖受体大小相仿。对此蛋白进行分析，结合生物信息学资料，获得其1980bp核酸序列，与拟南芥中几丁寡糖受体CERK1同源性达56.3%；其编码蛋白490个氨基酸，其中含有几丁/壳寡糖类物质结合保守区域“VTYPVRAEDNLTSIASETNVSADLIRRYNPG”，且有跨膜区，是潜在的壳寡糖受体。拟南芥中壳寡糖结合蛋白（AtCOSBP）大小12kD左右，由74个氨基酸组成，其亦含有几丁/壳寡糖结合保守区域，但蛋白分子量小，无跨膜区，推测其可起壳寡糖结合作用。已获得编码结合蛋白基因抑制植株，其抗病能力及壳寡糖诱抗响应能力下降，可确证其受体特性。同时利用蛋白-多糖/寡糖结合检测技术和荧光标记技术，明确了筛选所得蛋白与一系列糖的结合能力；利用定量PCR及生物信息学挖掘技术，获得COSBP的基因表达谱，COSBP在多种生物或非生物逆境胁迫、壳寡糖处理情况下均在短时间内表现出高表达，揭示其在抗病、抗逆、尤其是壳寡糖诱抗过程中均在早期发挥作用；利用分子模拟与对接技术，模拟了几丁寡糖、壳寡糖与受体的结合能力，发现四糖以上才具有结合能力。