IRS-1经由miR-503调控的BMPR1a信号阶段特异性调节成骨细胞分化与功能

How to regulate the bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) differentiate into osteoblast is one of the key points for the metabolic bone disease research. Our previously study showed that insulin receptor substrate 1 (IRS-1) can regulate the differentiation of osteoblasts, and found that IRS-1 knock-out mice decreased the bone mass when born but increased after one year, the expression of miR-503 was increased but it's target BMPR1a was decreased in MSC. After analyzed most of the studies about the function of BMPR1a, we supposed that IRS-1 would regulate the time-specific differentiation of MSC to osteoblast through BMPR1a mediated by miR-503. We will then observe the dynamic expression of miR-503,BMPR1a and bone metabolic markers in IRS-1 knock-out mice, evaluate the correlation between miR-503, BMPR1a and bone markers, and validate the time-dependent change of bone mass in IRS-1 out mice is due to the different roles of BMPR1a. BMPR1a transgene mice will be set up to observe the effect of BMPR1a on the MSC differentiation, IRS-1 will be knocked out in BMPR1a transgene mice by mated with IRS-1 knock-out mice, and through which we will showed that IRS-1 can regulate the time-dependent differentiation of MSC and the activity of osteoblast.

如何调控骨髓间质干细胞（MSC）向成骨细胞分化，是代谢性骨病防治研究取得突破的关键之一。我们前期研究表明胰岛素受体底物1（IRS-1）能调节成骨细胞分化，IRS-1剔除小鼠出生时骨量减少而1年后骨量增加，该小鼠MSC中miR-503及其靶基因BMPR1a分别表达上调和下调，综合有关BMPR1a能促进MSC向成骨细胞分化但成骨细胞中BMPR1a条件性剔除小鼠却呈现骨量增加的报道，我们推测IRS-1可经miR-503介导的BMPR1a信号阶段特异性调节成骨细胞分化与功能。为此，我们先观察IRS-1剔除小鼠MSC中miR-503及BMPR1a的表达变化及与成骨标志物表达的相关性，通过相关基因剔除或过表达，确定IRS-1剔除小鼠后期的骨量增加是否由miR-503增加或BMPR1a下降引起；建立BMPR1a转基因且IRS-1剔除的小鼠，确认IRS-1可经BMPR1a调节成骨细胞功能及阶段特异性分化。

胰岛素受体底物1（IRS-1）是胰岛素信号通路转导及其参与骨代谢的关键分子，但其作用的具体机制尚未完全阐明。本研究利用IRS-1缺失小鼠,进一步探讨IRS-1调控成骨细胞而参与骨代谢的机制。我们利用 micro-CT分析发现2月龄纯合子小鼠的骨小梁厚度（Tb.Th）明显低于野生型小鼠，而12月龄纯合子小鼠的Tb.Th明显高于野生型小鼠。通过骨形成相关基因芯片分析，我们发现在纯合子小鼠BMSCs中，miR-503表达下调，而其预测的靶基因Bmpr1a表达上调。分离纯合子和野生型小鼠的BMSCs，并向成骨诱导分化，发现野生型小鼠在诱导分化第12天，ALP的表达最高，而纯合子小鼠在第8天表达最高。通过双荧光素酶报告基因验证了Bmpr1a受miR-503靶向调控。在野生型新生小鼠颅盖骨细胞诱导分化第4天，转染miR-503的inhibitor和mimic，发现inhibitor组ALP的表达显著增高，而mimic组ALP表达下降，Bmpr1a以及骨形成标志物Runx2在inhibitor组的表达上调，而在mimic组的表达下调。转染Bmpr1a siRNA后，ALP和Runx-2表达下降，miR-503无显著改变。而共转染miR-503 inhibitor与Bmpr1a siRNA后，ALP与Runx2的表达无显著改变，这表明在前成骨细胞诱导分化的过程中，miR-503通过靶向作用于Bmpr1a调控骨形成。为了进一步验证IRS-1与miR-503在成骨分化过程中的相互作用，在野生型小鼠颅盖骨细胞诱导分化第4天，转染IRS-1 siRNA后，ALP以及Runx2的表达显著下调，miR-503的表达下降，Bmpr1a的表达上升。同样，共转染IRS-1 siRNA以及miR-503 mimic后，Bmpr1a、ALP和Runx2的表达无显著变化。这表明IRS-1可通过miR-503调控骨形成。而在此过程中，p-IRS-1、PI3K和p-AKT在IRS-1 siRNA组中均表达下降，当转染PI3K抑制剂LY294002后，PI3K、p-AKT和Runx-2的表达均下降，表明IRS-1通过PI3K-AKT信号通路正调控骨形成。因此，本研究发现IRS-1经由miR-503靶向作用于Bmpr1a通过PI3K-AKT信号通路调控骨形成，将对骨质疏松的靶向治疗提供理论依据和作用靶点。