RhoA-ROCK调控经典Wnt信号及成骨细胞分化的研究

我们以前的研究表明Rho small GTPase家族分子Rac1调控经典Wnt信号及骨骼发育（Wu X. et, al. Cell 2008;133:340-53），然而Rho small GTPase家族其它分子调控经典Wnt信号与否以及可能的分子机制尚不清楚。我们探索性的研究表明，RhoA-ROCK活性调控经典Wnt信号、bete-catenin在细胞质的稳定和入核，以及Wnt信号支配的成骨细胞分化。以此为基础，本项目拟首先在体外细胞模型上探索RhoA-ROCK调控经典Wnt信号和成骨细胞分化的分子机制，以及RhoA-ROCK作为经典Wnt信号的必要分子还是RhoA-ROCK作为非经典Wnt信号的分子调控经典Wnt信号。另外，利用经典Wnt信号缺失的基因修饰的小鼠进一步明确RhoA-ROCK是经典Wnt信号的必要分子与否，以及RhoA-ROCK调控经典Wnt信号支配的成骨细胞的分化。

以往的研究表明Rho small GTPase家族成员主要参与调控非经典Wnt信号而发挥对细胞骨架以及细胞内钙离子浓度的调控作用。而我们最新的研究表明Rho small GTPase家族成员之一Rac1参与调控经典Wnt信号及骨骼发育（Wu X.,et al. Cell 2008;133:340-53），但是Rho small GTPase家族其他分子调控经典Wnt信号与否及可能的分子机制尚不清楚。本项目首先通过RhoA-GTP Pull Down检测了Wnt信号对RhoA活性的影响，明确了经典及非经典Wnt信号都能够激活RhoA。接下来通过检测RhoA-ROCK对Lef1双荧光素酶报告基因活性及β-catenin蛋白水平和分布的影响，明确了RhoA-ROCK确实参与调控经典Wnt信号。同时利用一系列分子生物学手段也明确了RhoA-ROCK参与调控经典Wnt信号是通过IRS1-AKT信号通路实现的，激活RhoA-ROCK后IRS1及AKT的活性受到抑制，并进一步抑制β-catenin在丝氨酸552位点的磷酸化，导致β-catenin入核减少，抑制下游基因转录。另外在小鼠胚胎成纤维细胞ST2上也发现RhoA-ROCK的激活能够抑制其向成骨细胞的分化。在整体动物上，首先检测正常小鼠在2月龄、5月龄、7月龄及10月龄的骨密度，发现小鼠骨密度随年龄增加呈现先上升后下降的趋势，10月龄出现最低骨密度。因此从7月龄开始灌胃给予小鼠ROCK抑制剂Fasudil，给药3月后再次检测小鼠骨密度。和对照组10月龄小鼠相比，给药组10月龄小鼠骨量的丢失得到了明显的延缓，表明RhoA-ROCK能够通过调控经典Wnt信号而影响骨量。