基于β、M受体信号串扰探讨附子与贝母反药配伍对肺心病大鼠的毒效表征及机制

In our previous studies, it has been proved that compatibility of Fuzi and Beimu has synergistic effect on the early stage of Cor pulmonale in rats, and has a risk of increasing toxicity in the late stage of cor pulmonale, and its specific mechanism is not yet clear. In vitro studies showed that Fuzi is able to activate β-adrenergic receptor, while Beimu can inhibit M-muscarinic receptor. When the two components were compatible, can synergistically activate β2-adrenergic receptor. The in vivo study showed that combination of these two components significantly increased the expression of PKA, GRK2 and other proteins that are the downstream targets of β-adrenergic and M-muscarinic receptor. A large number of studies have shown that the signal crosstalk of β-adrenergic receptor and M-muscarinic receptor plays different physiological roles in the progression of various heart and lung disease. Accordingly, we hypothesized that the signal crosstalk between β-adrenergic and M-muscarinic receptor signal may be a possible molecular mechanism to explain the toxicity and therapeutic effect of Fuzi and Beimu compatibility in different stages of cor pulmonale in rats. The aim of this study is to investigate the toxicity and therapeutic effect of Fuzi and Beimu compatibility on β-adrenergic and M-muscarinic receptors signal crosstalk in a rat model of cor pulmonale. The main techniques used in this project include molecular tehcniques including qRT-PCR, Western Blot, mass spectrometry and computer simulation of molecular docking. The ultimate aim is to reveal the scientific connotation of "opposite" and "appropriate" of Fuzi and Beimu, and provide scientific basis for clinical safety of drug use.

我们前期研究中已证实：附子与贝母配伍对大鼠肺心病早期慢阻肺阶段具有协同改善作用，对晚期心衰阶段具有加重心脏衰竭的风险，其具体机制尚不明确。体外研究发现，附子具有β受体激动作用，贝母具有M受体拮抗作用，二者配伍后具有协同激动β2受体样作用；在体内，二者配伍显著升高β、M受体下游蛋白PKA、GRK2等蛋白表达。大量研究表明，β受体与M受体的信号串扰在心、肺不同疾病的发生发展中起着不同的生理作用。据此我们提出假设：β受体及M受体信号串扰可能是附子与贝母配伍对肺心病大鼠不同阶段毒效表征的可能分子机制。本项目拟采用RT-PCR、Western Blot等分子生物学手段及质谱成像、计算机模拟分子对接技术，考察附子与贝母配伍后对肺心病大鼠不同阶段的β受体及M受体相关信号通路的影响，阐明附子与贝母配伍对肺心病大鼠的毒效表征的具体机制，揭示二者“反”与“不反”的科学内涵，为临床安全用药提供科学依据。

附子与贝母反药组合是中药“十八反”配伍禁忌之一，二者配伍应用后的毒效变化规律，目前尚未有确切的认识。附子常用于心系疾病的治疗，贝母则多用于肺系疾病的治疗。本研究基于附子与贝母的功效特点，选择大鼠肺心病、心衰等模型，通过对反药组合作用于不同疾病阶段及不同疾病症候下的毒效表征及相关机制研究，揭示附子、贝母反药配伍禁忌的科学本质。.我们采用大鼠肺心病动物模型，系统验证了附子与贝母配伍对肺心病慢阻肺阶段及心衰阶段的毒效作用，并通过复制急性心衰、心肌梗死导致的慢性心衰模型验证了上述现象；通过Western Blot、离体组织灌流等分子生物学以及动物实验技术，从分子水平及离体动物水平进一步证实附子与贝母反药组合对肺心病前期有协同增效作用，对于肺心病晚期有配伍增毒的作用，并验证了其可能的机制；通过质谱成像技术、分子对接技术、双荧光素酶报告基因检测方法筛选出附子贝母对心、肺的可能毒效成分，并进行相关的毒效验证。.本研究结果表明，附子、贝母反药组合对肺心病慢阻肺阶段有明显的配伍增效作用，而对肺心病后期累及心脏的心衰阶段有明显的加重心衰的不良作用，表现出明显的药物配伍相反作用；附子与贝母反药组合对肺心病心衰阶段的不良反应机制可能与附子配伍贝母后协同激动β2-AR，激活β2-AR-Gs- PKA/CaMKⅡ信号通路以及PKA/GRK2磷酸化β2-AR介导的β2-AR-Gi信号通路有关；同时确认了以乌头原碱与贝母辛为代表的乌头碱与贝母碱可能是附子、贝母对肺心病大鼠不同阶段的不同毒效表征的可能物质基础。.本研究系统阐述了中药“十八反”理论中常用药附子与贝母反药配伍禁忌的科学内涵，明确二者配伍禁忌的可能条件，指导中医临床用药，另外，本研究发现，二者不是绝对的配伍禁忌，在治疗肺系疾病（不伴有心血管疾病）的情况下，二者可能可以酌情配伍使用，甚至有可能通过组分配伍，开发出治疗哮喘、肺心病等疾病新药，明确反药配伍禁忌的科学内涵，打破禁忌，将束之高阁的“反药”巧以应用，寻找亮点，为新药开发提出可能得新途径。.