附子直接生物学靶标发现及效-毒平衡的配伍减毒机制研究

The integration analysis of Radix Aconiti carmichaeli effect and toxicity is one of the core issues to be solved in the research on the safety of TCM, but there is still no evidence chain based on direct biological targets. Our previous studies found that the "effect-toxicity" balance of the Radix Aconiti was closely related to the regulation of the Adrenergic Nervous System (ANS) - Ca2+ cycle, and the licorice, the core drug of the Radix Aconiti compatibility, had the potential to stabilize the PLC/PKG-Ca2+ cycling effect. Based on this research idea, this project intends to use the UPLC-Q/TOF-coupled cell membrane chromatogram and intracellular signal transduction to analyze the spectrum and find out the Radix Radix Aconiti effect / toxicity components and the detoxification components of licorice; prepare the 18F-labeled and alkynylation molecule. Probes combined with PET technology for in vivo tracing and direct biological target capture, and cell-level co-localization studies; based on gene silencing and other technologies to conduct direct target validation and feasibility analysis of relevant target delivery; based on crosstalk pathways at all levels, it comprehensively explains the essence of the Radix Aconiti's "Revive the Yang for resuscitation" effect and the scientific connotation of the effect-toxicity balance; multigroup approach explores the aconite-licorice compatibility intervention network and analyzes the "quantity - time – effect - toxicity" of the corresponding groups in different phases of heart failure. The relationship provides a theoretical basis for the application of Radix Aconiti’s safety norms and the improvement of modern therapeutic schedule of heart failure.

附子的效-毒整合分析是中药安全性研究亟待解决的核心问题之一，但目前尚缺乏基于直接生物学靶标的证据链。我们前期研究发现附子效毒平衡与交感神经系统（ANS）-Ca2+循环调控密切相关，而附子配伍减毒的核心药物甘草具有潜在的稳定PLC/PKG-Ca2+循环作用。基于此研究思路，本项目拟利用基于UPLC-Q/TOF偶联细胞膜色谱及胞内信号转导的谱效筛选方法解析附子效毒成分以及甘草解毒成分；制备18F标记关键药效成分探针结合PET技术进行活体示踪定位；制备炔基化分子探针进行直接生物学靶点捕获及细胞水平的共定位研究；以基因沉默等技术为基础开展直接靶标验证及相关靶点通路递送的可行性分析；基于通路串扰层面综合阐释附子效-毒成分作用机制及甘草配伍减毒的效-毒平衡生物学证据链；并结合多组学手段探寻心衰不同阶段附子甘草配伍的“量-时-效-毒”关系，为附子的安全规范应用以及完善现代治疗心衰方案提供理论基础。

附子的效-毒整合分析是中药安全性研究亟待解决的核心问题之一，附子-甘草药对既是温阳补中的常用药对，又是中药配伍中“增效减毒”的代表药对，研究表明甘草可协同增加附子的强心作用，并在一定程度上缓解附子引起的心肌损伤，但目前尚缺乏基于直接生物学靶标的证据链，对于附子安全用药的剂量范围和时间窗也尚缺乏深入研究和共性认识。本项目提出附子“效-毒”平衡与通过其直接生物学靶标调控ANS-Ca2+循环密切相关；甘草配伍可能通过对相关信号通路稳定Ca通道而减轻附子心脏毒性这一学术假说，按照项目计划书安排开展了系列研究。研究首先利用基于心衰关键靶蛋白过表达的双荧光筛选体系和活细胞钙离子成像结合fluo-4/AM荧光探针分析，结合UPLC-Q/TOF分离鉴定系统解析附子效毒成分以及甘草解毒成分，明确了附子灵在黑顺片中对钙通道蛋白、肾上腺素受体的作用，并以离体心脏灌流实验明确了附子提取物可诱发小鼠产生室性心律失常，证实了其与甘草配伍有缓解心律失常的作用；随后，以小动物micro CT成像系统进行药物靶部位的活体成像，并以质谱成像明确主要成分的靶组织分布，证实给药1h、2h等时间点药物成分在重要脏器中的含量，为靶点垂钓研究明确了给药及组织分布时间；随后制备炔基化分子探针，用磁性微球捕获分离靶蛋白及相关结合蛋白，开展药物效-毒直接靶点捕获研究及细胞水平的共定位研究，明确了其在心脏中的主要生物学靶点之一为MDH2；采用Chou-Talalay中效原理评估附子灵与甘草次酸的配比关系，证实了其最佳配比范围;随后以分子生物学、系统生物学技术开展直接靶标验证、热稳定分析，证实其主要生物学靶点MDH2可与CALR相互作用，从而调节钙离子通路上的CASQ2、MEF2C等相关蛋白，基于钙通道综合阐释附子效-毒成分作用机制及甘草配伍减毒的效-毒平衡作用机制；利用不同模型明确了心衰不同阶段附子甘草配伍的“量-时-效-毒”关系，为附子的安全规范应用以及完善现代治疗心衰方案提供理论基础。