甜菜Owen型细胞质雄性不育恢复基因（Rf）的克隆及PPR基因家族的研究

Isolation and cloning for crops fertility genes has become one of hot research areas for breeding workers. This study intends to identify BAC clones covering Rf1 gene and sequencing full-length clones using map-based cloning and Homologous Clone methods on the basis of construct of fine genetic map and physical map, design primers according to homologous sequence of restorer gene ，and scan BAC clone on physical map. The purpose of this study is also to get Rf1 candidate ORF by means of gene predict, gene feature analysis and parent sequence variation analysis. Successful clone of fertility restorer gene for cytoplasmic male sterility in sugar beet is possible to make for breeding new type restores lines bearing excellent character by transgene method, which will realize key breakthroughs for the hybrid seed production in sugar beet and greatly promote sugar beet breeding development in our country. In addition, this study will provide a theoretical foundation for analyzing sugar beet cytoplasmic male sterility 、 fertility restorer system and explaining the relation between nuclear genes coding protein and mitochondrial gene expression by researching PPR gene family distribution and quantity, coding protein structure and expression character.

作物育性基因的分离克隆近年来已经成为育种工作者研究的热点之一。本研究拟利用图位克隆和同源序列克隆两种方法相结合的策略，在构建Rf1精细遗传图谱和物理图谱的基础上，根据恢复基因同源序列设计引物对物理图谱上的BAC克隆进行扫描，鉴定出包含Rf1基因的BAC克隆并对其全长测序，通过基因预测和特征分析及亲本序列差异分析获得了Rf候选ORF，进而克隆Rf基因。甜菜细胞质雄性不育育性恢复基因的成功克隆，可以通过转基因方法，培育具有优良性状的新型恢复系，可实现甜菜杂种优势利用的重大突破，从而极大地推动我国甜菜育种的发展。此外，通过研究甜菜中PPR基因家族的分布和数量，编码蛋白的结构和表达特点，对解析甜菜细胞质雄性不育、育性恢复系统，明确核基因编码的蛋白与线粒体基因表达调控之间的关系提供了理论依据。

甜菜是典型的异交作物，杂种优势明显。但由于花期小，且为无限花序等原因，生产上制种时进行人工去雄几乎不可能。因此，选育三系对甜菜杂种优势利用尤为的重要。而甜菜三系选育中保持系最为重要，没有保持系就没有不育系。本项目开发出快速鉴定甜菜不育系、保持系及恢复系的引物。利用该引物可以快速准确鉴定出甜菜Owen型不育系、保持系及恢复系。我国传统的选育方法，要想选育出保持性能优良稳定（对应的不育系不育率高）保持系（或不育系），至少需要4-6年，即使是利用当年抽薹基因型甜菜快速选育，也需要13-16个月的时间。而利用本项目开发的引物，可以在1周的时间内完成鉴定。对提高我甜菜育种水平，缩短与发达国家差距具有重要意义。.通过本项目研究获得了与Rf1紧密连锁的AFLP标记6个，并构建了Rf1基因的遗传连锁图。初步明确了甜菜花期Owen型雄性不育及保持系育性间的蛋白差异情况；明确了甜菜Owen型细胞质雄性不育系育与保持系间分子差异。并筛选出了可以准确鉴定不同育性材料的分子标记引物。利用RNA-seg技术对甜菜不育系、保持系材料进行转录组学研究发现：保持系与不育系之间的差异基因较多，涉及到的基因功能分别有转录因子基因、ATP合成基因、激酶合成基因、HIS组蛋白合成基因、酶及次级活性物质合成基因、孢子体形成基因、离子结合与调控基因等。初步筛选出15个与育性相关基因进行实时荧光定量PCR实验，验证基因差异表达的时空特性。15个基因中有10个特定程度的表达。在不同发育时期差异基因的上下调表达趋势与测序结果基本一致。育性相关的差异基因在CMS材料中均出现不同程度表达下调的现象，可能与雄性不育植株的花器官败育有一定的联系。.利用本项目发表科研论文21篇，培养研究生13名，其中硕士3在读，博士在读5人。）。申请国家发明专利3项；获得黑龙江省科技进步三等奖1项。