水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf4的分子机理

Cytoplasmic male sterility (CMS) and its fertility restoration are important genetic bases for utilization of heterosis. Recently, our team has cloned a novel mitochondrial gene, WA352, causing CMS-WA in rice and its restorer gene Rf4. WA352 causes CMS by its hijacking interaction with the nucleus-encoded mitochondrial protein COX11, However, the molecular mechanism of Rf4 is unclear. In previous works, F-A and F-B were found to interaction with RF4. we used CRISPR/Cas9 to knockout the F-A or F-B gene in ZSR5 caused pollen abortion, indicating that F-A, F-B might work alone with Rf4 to restore fertility in rice. In this study, we want to analyze the biological functions of the F-A and F-B by genetic transformation. Furthermore, yeast two-hybrid assays, BiFC and Co-IP would be carried out to confirm whether the F-A, F-B and Rf4 work as a complex and EMSA would be performed to test whether F-A, F-B and RF4 interact with WA352 transcripts directly. Through this project, we aim to elucidate the molecular mechanism of Rf4, which may offers opportunities to further exploit rice heterosis in hybrid rice production.

水稻细胞质雄性不育及其恢复性是水稻杂种优势利用的遗传基础。本实验室克隆了水稻野败型细胞质雄性不育基因WA352及其恢复基因Rf4，阐明了不育的分子机理，但是Rf4的分子机理还不清楚。在前期的工作中，我们通过酵母双杂交筛选到RF4的两个互作因子F-A和F-B，并利用CRISPR/Cas9对水稻野败型细胞质雄性不育Rf4单基因复育系珍汕R5(含野败细胞质和Rf4)中的F-A或F-B进行敲除，敲除突变体能导致花粉败育。本项目拟用F-A和F-B的突变体分析其功能以及与恢复途径的关系；另外，利用酵母双杂交、双分子荧光互补以及Co-IP验证F-A、F-B和RF4是否为同一个恢复复合体的成员；并通过原核表达F-A、F-B、RF4的蛋白以及体外转录WA352，利用EMSA研究F-A、F-B及RF4与WA352的结合试验。本项目将阐明恢复基因Rf4的分子机理，为进一步利用水稻杂种优势进行杂交稻育种奠定基础。

细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS）及其恢复性（Restoration of Fertility, Rf）是作物杂种优势利用的遗传基础，研究其分子机理对于提高农作物的产量具有重要的意义。前期，本人克隆了水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf4，证实了RF4是通过抑制线粒体不育基因WA352的mRNA表达而恢复育性，属于转录后水平的育性恢复，但是RF4是如何结合与介导WA352 mRNA降解的分子机理还不清楚。为了研究RF4的恢复机理，本项目通过酵母双杂交筛选到RF4的2个互作蛋白（F-A和F-B），并利用Pull-down和BiFC等技术证明了RF4与F-A和F-B存在互作；进一步利用CRISPR/Cas9对水稻野败型细胞质雄性不育Rf4单基因复育系珍汕R5(含有野败细胞质和Rf4)中的F-A或F-B进行敲除，敲除突变体（移码突变）的花粉育性都出现了不同程度的下降，说明F-A和F-B与RF4形成一个育性恢复复合体，缺失任何一个因子都影响该复合体的功能。此外，本项目还重建了Rf4（rf4）起源演化路径，为深入研究不育基因和恢复基因的协同进化奠定了基础。在过去3年中，受本项目资助发表的SCI论文2篇；培养硕士毕业生2人、本科毕业生1人；项目组成员参加国内学术会议3人次；经费使用规范合理，较好的完成项目任务。