水稻细胞质雄性不育恢复基因RF-FA的图位克隆和功能研究

Cytoplasmic male sterility (CMS) has been extensively used for hybrid seed production in many crops. The new cytoplasmic male sterility (CMS-FA) is a novel cytoplasmic male sterility system, which is different from Wild Abortive, Boro II and Hong-Lian CMS. We found that the fertility restoration was controlled by one locus. All of the conventional cultivated rice could not restore the fertility of the new CMS line, and the restorer gene only existed in the specific wild rice. We mapped the RF-FA gene to the 35 kb region on chromosome 10 of Jinhui 3 through genetic populations. We constructed a whole genome BAC library of rice Jinhui 3 and screened two BACs containing the target region. Four candidate genes were predicted after BAC sequencing. We constructed genetic complementation vectors and gene editing vectors for these four candidate genes and expected to validate the function of candidate genes by means of gene complementation and gene editing knockout. At the same time, we expect to understand the function of the restorer gene by gene expression analysis, interact proteins screening, subcellular localization and cytological observation. Through the cloning and function study of this restorer gene, we can get a clearer understanding of the mechanism of this gene and at the same time make us more specific in the breeding of the restorer line.

细胞质雄性不育已经广泛用于作物的杂交种子生产过程中。水稻新质源细胞质雄性不育（CMS-FA）是一种不同于野败型、包台型和红莲型的新型细胞质雄性不育系统。我们发现其育性恢复受1个位点控制，常规栽培稻都不能恢复新质源不育系的育性，只有特定的野生稻中存在恢复基因。我们通过构建遗传群体将恢复基因RF-FA定位在水稻金恢3号第10染色体上35Kb的范围内。我们构建了水稻金恢3号的全基因组BAC文库，并筛选到了两个含目标区段的BAC。通过对BAC测序后预测到了四个候选基因。我们构建了这4个候选基因的遗传互补载体和基因编辑载体，期望通过基因互补和基因编辑敲除的方法验证候选基因的功能。同时我们希望通过对恢复基因表达特征分析、互作蛋白的筛选、亚细胞定位和细胞学观察实验来了解恢复基因的功能。通过对该恢复基因的克隆和功能研究可以使我们对这个基因的作用机理有更清楚的了解，同时可以使我们在恢复系选育上更有针对性。

水稻是世界上重要的粮食作物，杂交水稻的应用为我国粮食增产做出了重要贡献。细胞质雄性不育已经广泛用于作物的杂交种子生产过程中。水稻新质源细胞质雄性不育（CMS-FA）是一种不同于野败型、包台型和红莲型的新型细胞质雄性不育系统。这种类型的雄性不育已经应用到了水稻生产中，但是其对应的恢复基因还没有克隆。. 我们在前期的研究发现水稻新质源细胞质雄性不育的育性恢复受1个位点控制，常规栽培稻都不能恢复新质源不育系的育性，只有特定的野生稻中存在恢复基因。我们通过构建遗传群体将恢复基因定位在水稻金恢3号第10染色体上35Kb的范围内。构建了水稻金恢3号的全基因组BAC文库，并筛选到了两个含目标区段的BAC。通过对BAC测序后预测到了四个候选基因。我们构建了分别含有两个候选基因和只含有一个候选基因的互补载体。通过互补转化后获得了阳性植株，在T0代和T1代对转基因植株进行表型考察。结果，含有ORF6和ORF11的载体转化到不育系后能够恢复不育系的育性，结实率在70%以上。含有单个基因ORF6的载体转化不育系后能够恢复不育系的育性。我们也构建了基因编辑载体，通过在恢复系中编辑敲除ORF6能够导致植株不育。通过遗传学实验，我们验证了四个候选基因的功能，克隆了水稻新质源细胞质雄性不育的恢复基因。. 对恢复基因进行遗传进化分析，发现恢复基因与水稻中已克隆的Rf1a和Rf4在进行上很相近。亚细胞定位实验证明恢复基因定位在线粒体中。对恢复基因在根、茎、叶、穗和花药中的表达特征进行分析，发现恢复基因在根中的表达量最低，在花药中表达量最高。通过以上工作，我们克隆了恢复基因，并且对恢复基因的功能有了进一步的了解。同时，恢复基因的克隆也可以让我们更好的把它应用到水稻育种中。