龙牙楤木三萜皂苷心肌保护与调控心肌肌浆网钙转运蛋白信号传导通路的相关性及构效关系研究

肌浆网钙失衡是心肌损伤、心律失常的病理基础。龙牙楤木系五加科楤木属植物，具有补气安神、活血化瘀的功效。我们从80年代即开始了对龙牙楤木的系统研究，通过研究发现了其总皂苷及单体皂苷之一DCIVa治疗冠心病、心绞痛，抗心律失常的新用途，并获临床研究批件，申报了3项国家发明专利。临床与实验研究表明，楤木三萜皂苷可增强心肌收缩力、保护心肌损伤、抗心力衰竭。前期研究发现，DCIVa抗心肌缺血再灌注损伤、抑制细胞内钙超载，提示楤木三萜皂苷可能通过影响SR钙转运蛋白信号传导通路实现对受损心肌钙失衡的有益调控。本项目拟对8种龙牙楤木不同类型皂苷成分对心肌保护作用的构效关系进行研究，发现具有新药开发前景的先导化合物，并阐明其正性肌力、保护心肌与调控蛋白激酶、磷酸酶等信号传导上游环节，调整SERCA、PLB及RyR等SR钙转运蛋白的修饰、功能的相关性。探索龙牙楤木三萜皂苷保护心肌的物质基础和分子蛋白机制。

本项目对从龙牙楤木总皂苷中分离提取出的八种楤木皂苷单体进行了心肌保护活性筛选及构效关系分析。结果表明齐墩果烷型3位连有葡萄糖醛酸的三萜皂苷具有心肌细胞保护作用，并且在葡萄糖醛酸3位连接糖的皂苷活性更好，证明不同结构的皂苷单体对心肌细胞的保护作用有所差异，产生差异的原因主要在于苷元不同、苷元上所连糖的种类、个数与位置不同。同时，进一步对活性显著且收率较高的两个单体成分Elatoside C 和Araloside C的心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制进行了深入研究。我们的结果证明Elatoside C能够显著抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤，包括提高心肌细胞存活率，维持线粒体膜电位稳定，降低线粒体ROS水平，减少心肌细胞凋亡。并且可以显著改善再灌注后的心脏收缩功能，抑制 I/R 引起的心肌氧化应激反应。同时，Elatoside C 能够抑制I/R诱导的线粒体损伤及线粒体凋亡，包括抑制线粒体ROS水平，线粒体膜通道孔(mPTP)开放，细胞色素c的释放，Bax线粒体转位及Caspase-9/-3的表达水平。此外，Elatoside C 能够维持肌浆网SERCA活性，调节肌浆网内钙浓度。进一步对分离的原代成年大鼠心肌细胞研究显示，Elatoside C能够逆转I/R引起的心肌肌节收缩幅度（PS）, 最大收缩速度(+dL/dt)及舒张速度(-dL/dt) 下降, 及细胞达到舒张时最大长度的90.0 %的时间(TR90) 和细胞收缩达峰值时间(TPS) 的延长；同时，Elatoside C能显著改善I/R导致的心肌静息态钙水平升高、钙瞬变幅度降低、钙瞬变最大上升速率降低,及胞内钙瞬变衰减率延长；上述结果证明Elatoside C对I/R损伤的保护作用与提高肌浆网SERCA活性，改善钙瞬变及细胞收缩功能有关。Araloside C的结果显示Araloside C可明显降低I/R对心脏收缩功能的抑制，包括显著增加I/R心肌左室收缩压，左室内压最大上升/下降速率，并对心率有一定的提高作用。通过对原代成年大鼠心肌细胞实时测量肌节收缩与钙瞬变的结果发现，Araloside C可显著改善I/R心肌细胞收缩功能，降低钙超载，提高钙瞬变幅度。而加入钙调蛋白CaMKⅡ的抑制剂KN93后，Araloside C的作用效果显著下降，提示其发心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能与调控钙调蛋白CaMKⅡ有关