柑橘CsPRP4基因导致植株矮化的功能解析

Dwarf is one of important agronomic traits, which is a very active area for molecular genetics and breeding in fruit crop. In our previous study, a proline rich protein gene, CsPRP4, which is associated with plant drawing, was cloned from citrus. Typical dwarfing traits, including reduced-size leaves, shortened stem internodes and disappeared thorns was observed in RNAi lines where the CsPPP4 gene was down-regulated. However, the molecular mechanism how CsPRP4 lead citrus to dwarfing is not clear, which awaits further functional evidence through bioinformatics, cytology and molecular biology. Based on our recent data, the work in this study will focus on bioinformatics analysis of CsPRP4 gene, the expression level of CsPRP4 in different tissues and under different hormone and stress treatments, cytological observations of transgenic plants, subcellular location, transcriptomic analyses of transgenic plants, the changes in endogenous hormone of transgenic plants, enzymatic activity assay; analysis of CsPRP4 promoter activity. This study not only comprehensively analyzed the biologic functions of CsPRP4 resulting in plant dwarfing, but also provide important theoretical significance and application value for the molecular genetics and breeding of plant dwarfing in citrus.

矮化是一种重要的农艺性状,矮化功能基因的研究与应用一直是果树分子遗传育种与分子生物学的研究热点。在前期工作中，我们获得了一个与柑橘植株矮化相关的CsPRP4基因（富含脯氨酸蛋白基因）。干扰CsPRP4基因导致柑橘植株矮小、叶面积减少与节间变短等，但该基因如何使柑橘植株产生上述性状的生物学基础还不清楚，需要解析。本课题在前期研究基础上，拟采用生物信息学、细胞生物学和分子生物学技术手段对CsPRP4基因的生物功能进一步深入研究，主要包括该基因的生物信息学分析；在不同组织、逆境及外源激素处理下的表达分析；转基因植株的细胞学观察；亚细胞定位分析；转基因植株转录组分析、内源激素水平、矮化相关酶活性分析以及该基因的启动子活性分析等。研究成果不仅可以全面剖析CsPRP4基因在柑橘植株矮化中的作用，而且对柑橘矮化分子育种具有重要的理论意义和应用价值。

柑橘富含脯氨酸蛋白基因（CsPRP4）编码一种细胞壁蛋白，CsPRP4柑橘转基因植株中功能缺失导致植株矮化、叶面积减少与节间变短，但是其导致植株矮化的分子机理并不清楚。本课题采用生物信息学、细胞生物学和分子生物学技术手段对CsPRP4基因的生物功能进一步深入研究。首先以奥林达夏橙（Citrus sinensis (L.) cv. Olinda）离层为材料，采用RACE方法，最终得到的CsPRP4基因全长为1 384 bp的cDNA，其ORF编码194个氨基酸、预测分子量和等电点分别为20.79KD和8.71的蛋白。对比该基因的ORF和基因组DNA的结果显示,该基因含有1个内含子。Blastp分析发现预测的CsPRP4蛋白与烟草NtPRP蛋白和拟南芥AtPRP4蛋白分别有58%和53%的相似性。qRT-PCR结果表明CsPRP4基因在幼苗的根、茎、叶上都有表达，以叶片中表达量为最高。CsPRP4基因的表达也受乙烯（ET）、生长素（IAA）、甲基茉莉酸（MeJA）和水杨酸（SA）的强烈诱导。构建了该基因启动子与GUS报告基因的融合表达载体并转化了拟南芥，在T3代转基因植株中，GUS活性受乙烯、生长素、甲基茉莉酸、水杨酸和赤霉素（GA3）的诱导。洋葱表皮亚细胞定位结果说明CsPRP4是一个细胞膜锚定蛋白。为了进一步分析该基因的功能，我们构建了CsPRP4基因的过表达和RNAi载体并成功获得遗传转化植株。表型分析显示，RNAi植株与过表达转基因的植株和对照植株相比叶片变小，枝条节间变短、刺消失。在显微结构上，RNAi植株中的细胞数目减少、体积变小。超微结构分析显示，RNAi植株叶肉细胞内的淀粉颗粒明显减少。转基因植株细胞壁成分未发生变化；RNA-Seq结果显示RNAi植株中淀粉和糖代谢途径以及激素信号转导途径发生改变；内源激素测定显示RNAi植株内ZR和ZT含量降低。本研究成果对柑橘矮化分子育种具有重要的理论意义和应用价值。项目资助发表论文2篇（SCI论文1篇，国内A1论文1篇），待发表论文2篇。培养硕士生2名，其中1名已经取得硕士学位，1名在读。项目投入经费20万元，支出13.404676万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费 6.595324万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。